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非天然产物S-雌马酚(equol)具有抗氧化、抗癌、类雌激素以及抗雌激素等多种生物活性。目前已知，部分人和动物的肠道菌群能将摄入体内的大豆异黄酮黄豆苷原(isoflavone daidzein)转化为S-雌马酚，研究人员已从大鼠、小鼠、猪、鸡的粪样菌群中分离得到不同的S-雌马酚产生菌，迄今已报道的S-雌马酚产生菌涉及Eggerthella、Asaccharobacter、Lactobacillus、Adlercreutzia、Coriobacteriaceae、Eubacterium、Acinetobacter、Slackia和Proteus等9个属。目前报道的S-雌马酚产生菌绝大部分为严格厌氧细菌，仅2株被报道为兼性厌氧细菌，其中一株是日本学者分自人肠道菌群的乳酸乳球菌Lactococcus sp.20-92，但菌株20-92只有在严格厌氧条件下才具有转化活性;另一株兼性厌氧细菌是国内学者分自大鼠肠道的变形杆菌Proteus mirabilis LH-52，菌株LH-52虽然能在有氧条件下将黄豆苷原转化为S-雌马酚，但转化能力不稳定，不适合规模化生产。目前，雌马酚的合成主要有两种方法，一种是人工化学合成，另一种是微生物生物合成。由于雌马酚为手性化合物，因此，利用人工化学合成的雌马酚为S-雌马酚和R-雌马酚等量存在的外消旋体。另外，用化学法合成雌马酚时需要价格昂贵的化学催化剂，且反应副产物多，分离纯化困难。除化学合成外，还可以以S-雌马酚产生菌为生物酶源，利用微生物转化法对S-雌马酚进行生物合成。值得一提的是，目前报道的利用微生物转化法合成的雌马酚均为100％S-型雌马酚，这恰与从人体检测到的雌马酚也为100％S-型雌马酚相吻合。利用微生物转化法合成S-雌马酚的不利方面是，绝大多数S-雌马酚产生菌对氧气极为敏感，该类菌株的转接、生长和转化均需在严格厌氧环境下进行，转化过程中一点点氧气的渗入都会显著影响菌株的转化效率，严重时甚至导致菌株完全不转化而导致“绝产”，而长期维持严格厌氧环境则需要大量的资金投入。因此，S-雌马酚产生菌的严格厌氧特性已成为S-雌马酚规模化生产的瓶颈。
本实验室前期从公鸡粪样菌群中分离得到一株严格厌氧S-雌马酚产生菌Eggerthella sp.HAU-JLC44，以菌株Eggerthella sp.HAU-JLC44的基因组DNA为模板，成功克隆出参与S-雌马酚合成的三个功能基因，即将黄豆苷原还原为二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD）的dgr，将DHD还原为四氢黄豆苷原（tetrahydrodaidzein，简称THD）的dhdr以及将THD还原为S-雌马酚的thdr，并且构建了共表达重组子E.coil BL21/pETDduet-1-TDHDR-DGR，但该共表达重组子在有氧条件下对底物黄豆苷原的最大转化浓度仅为0.4mmol/L，产物包括中间代谢产物DHD和终产物S-雌马酚，其中S-雌马酚的产量仅为0.2mmol/L左右。尽管利用共表达大肠杆菌重组子全细胞转化首次实现了从底物黄豆苷原到产物S-雌马酚的有氧转化，但转化效率较低，并且转化结束后，在转化体系中仍有大量中间代谢产物DHD的积累。
为解决中间代谢产物DHD积累的问题，本研究以Egg65erthella sp.HAU-JLC44的基因组DNA为模板，克隆得到了能使R-DHD和S-DHD间发生相互转化的二氢黄豆苷原消旋酶基因ddrc，并对二氢黄豆苷原消旋酶DDRC的活性进行验证。研究结果表明，将本实验室前期得到的三个大肠杆菌重组子（即E.coli BL21/pET-30a-DGR、E.coli BL21/pET-30a-DHDR和E.coli BL21/pET-30a-THDR）与本研究构建的携带二氢黄豆苷原消旋酶基因ddrc的大肠杆菌重组子E.coli BL21/pET-30a-DDRC进行混菌培养后，该混菌培养物能将加入到培养基中的底物黄豆苷原(0.4mmol/L)全部转化为S-雌马酚，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.361mmol/L，S-雌马酚的平均转化率为90.25％。未接种重组子E.coli BL21/pET-30a-DDRC的混菌培养物则将浓度为0.4mmol/L的底物黄豆苷原分别转化为DHD和S-雌马酚，其中S-雌马酚的平均浓度仅为0.2mmol/L左右。该研究结果表明，二氢黄豆苷原消旋酶DDRC能够有效促进R-DHD和S-DHD之间的相互转化，进而促进中间代谢产物DHD向S-雌马酚的转化，显著提高了终产物S-雌马酚的产量。
为进一步提高S-雌马酚的转化效率，本研究构建了双质粒共表达重组子E.coliBL21/pET-30a-TDHDR/pACYCduet-1-DDRC-DGR，并对其转化条件进行优化研究。研究结果表明，在优化后的条件下，双质粒共表达重组子E.coliBL21/pET-30a-TDHDR/pACYCduet-1-DDRC-DGR能高效转化底物黄豆苷原的最大浓度为0.6mmol/L，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.561mmol/L，平均转化率为93.43％。此外，通过转化动态分析发现，二氢黄豆苷原还原酶DHDR为S-雌马酚合成过程中的限速酶。为提高限速酶的酶活，本研究构建了多种基因共表达系统，通过高效液相检测发现，转化能力最强的为双质粒共表达重组子E.coliBL21/pET-30a-DHDR-THDR/pACYCduet-1-DDRC-DGR，该重组子在有氧条件下能将底物为0.8mmol/L的底物黄豆苷原全部转化为S-雌马酚，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.693mmol/L，平均转化率为86.63％。通过对限速酶基因进行改造发现，将限速酶基因的第217位的Trp突变成Ala时，共表达系统对底物黄豆苷原的最大转化浓度由原来的0.8mmol/L提高到1.0mmol/L，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.886mmol/L，平均转化率为88.60％。最后，本研究尝试双阶段不同温度转化法转化底物黄豆苷原，结果发现，双阶段不同温度转化法对底物黄豆苷原的最大转化浓度由原来的1.0mmol/L提高到1.2mmol/L，生成的S-雌马酚的平均浓度为1.144mmol/L，平均转化率为95.33％。总之，通过本研究显著提高了大肠杆菌共表达重组子对底物黄豆苷原的转化能力，终产物S-雌马酚的产率比实验室之前构建的表达系统提高5倍，为今后S-雌马酚在有氧条件下的规模化生产奠定了基础。
本实验室前期从公鸡粪样菌群中分离得到一株严格厌氧S-雌马酚产生菌Eggerthella sp.HAU-JLC44，以菌株Eggerthella sp.HAU-JLC44的基因组DNA为模板，成功克隆出参与S-雌马酚合成的三个功能基因，即将黄豆苷原还原为二氢黄豆苷原（dihydrodaidzein，简称DHD）的dgr，将DHD还原为四氢黄豆苷原（tetrahydrodaidzein，简称THD）的dhdr以及将THD还原为S-雌马酚的thdr，并且构建了共表达重组子E.coil BL21/pETDduet-1-TDHDR-DGR，但该共表达重组子在有氧条件下对底物黄豆苷原的最大转化浓度仅为0.4mmol/L，产物包括中间代谢产物DHD和终产物S-雌马酚，其中S-雌马酚的产量仅为0.2mmol/L左右。尽管利用共表达大肠杆菌重组子全细胞转化首次实现了从底物黄豆苷原到产物S-雌马酚的有氧转化，但转化效率较低，并且转化结束后，在转化体系中仍有大量中间代谢产物DHD的积累。
为解决中间代谢产物DHD积累的问题，本研究以Egg65erthella sp.HAU-JLC44的基因组DNA为模板，克隆得到了能使R-DHD和S-DHD间发生相互转化的二氢黄豆苷原消旋酶基因ddrc，并对二氢黄豆苷原消旋酶DDRC的活性进行验证。研究结果表明，将本实验室前期得到的三个大肠杆菌重组子（即E.coli BL21/pET-30a-DGR、E.coli BL21/pET-30a-DHDR和E.coli BL21/pET-30a-THDR）与本研究构建的携带二氢黄豆苷原消旋酶基因ddrc的大肠杆菌重组子E.coli BL21/pET-30a-DDRC进行混菌培养后，该混菌培养物能将加入到培养基中的底物黄豆苷原(0.4mmol/L)全部转化为S-雌马酚，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.361mmol/L，S-雌马酚的平均转化率为90.25％。未接种重组子E.coli BL21/pET-30a-DDRC的混菌培养物则将浓度为0.4mmol/L的底物黄豆苷原分别转化为DHD和S-雌马酚，其中S-雌马酚的平均浓度仅为0.2mmol/L左右。该研究结果表明，二氢黄豆苷原消旋酶DDRC能够有效促进R-DHD和S-DHD之间的相互转化，进而促进中间代谢产物DHD向S-雌马酚的转化，显著提高了终产物S-雌马酚的产量。
为进一步提高S-雌马酚的转化效率，本研究构建了双质粒共表达重组子E.coliBL21/pET-30a-TDHDR/pACYCduet-1-DDRC-DGR，并对其转化条件进行优化研究。研究结果表明，在优化后的条件下，双质粒共表达重组子E.coliBL21/pET-30a-TDHDR/pACYCduet-1-DDRC-DGR能高效转化底物黄豆苷原的最大浓度为0.6mmol/L，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.561mmol/L，平均转化率为93.43％。此外，通过转化动态分析发现，二氢黄豆苷原还原酶DHDR为S-雌马酚合成过程中的限速酶。为提高限速酶的酶活，本研究构建了多种基因共表达系统，通过高效液相检测发现，转化能力最强的为双质粒共表达重组子E.coliBL21/pET-30a-DHDR-THDR/pACYCduet-1-DDRC-DGR，该重组子在有氧条件下能将底物为0.8mmol/L的底物黄豆苷原全部转化为S-雌马酚，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.693mmol/L，平均转化率为86.63％。通过对限速酶基因进行改造发现，将限速酶基因的第217位的Trp突变成Ala时，共表达系统对底物黄豆苷原的最大转化浓度由原来的0.8mmol/L提高到1.0mmol/L，生成的S-雌马酚的平均浓度为0.886mmol/L，平均转化率为88.60％。最后，本研究尝试双阶段不同温度转化法转化底物黄豆苷原，结果发现，双阶段不同温度转化法对底物黄豆苷原的最大转化浓度由原来的1.0mmol/L提高到1.2mmol/L，生成的S-雌马酚的平均浓度为1.144mmol/L，平均转化率为95.33％。总之，通过本研究显著提高了大肠杆菌共表达重组子对底物黄豆苷原的转化能力，终产物S-雌马酚的产率比实验室之前构建的表达系统提高5倍，为今后S-雌马酚在有氧条件下的规模化生产奠定了基础。