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卵巢癌(ovarian cancer，OC)是最致命的妇科恶性肿瘤。随着中国逐渐进入老龄化社会，卵巢癌发病率逐年上升，其死亡率在妇科肿瘤中居首位。卵巢癌的发病率仅低于子宫颈癌和子宫内膜癌，它是女性生殖系统中常见的疾病。
由于早期无明显临床症状，卵巢癌多见于晚期，主要筛查方法有经阴道超声、血清CA-125等。临床实践表明，这些方法存在一定的局限性。因此，当务之急是寻找可靠的肿瘤标志物用于卵巢癌的早期诊断和治疗。
人附睾蛋白4(Human epididymis protein 4，HE4)又名为WFDC2(WAP four-disulfide core protein 2)，主要表达于上呼吸道、肾脏远曲小管、生殖系统、结肠粘膜中，此外在卵巢组织中表达明显上调。HE4存在于血清、尿液和组织中，是新型的肿瘤标志物之一。在卵巢癌中研究发现，HE4沉默能够明显促进卵巢癌细胞凋亡、粘附，并能显著抑制细胞的增殖、侵袭、迁移以及移植瘤的生长。然而，HE4在卵巢癌中的具体作用机制还尚不清楚。
为研究HE4对卵巢癌恶性生物学行为的调控作用及机制，本研究首先在临床水平利用qRT-PCR、Westernblot和免疫组化检测了HE4在卵巢癌组织中的表达情况，又用ELISA检测了卵巢癌患者血清和尿液中HE4的表达情况，分析了血清HE4和尿液HE4水平的相关性以及二者诊断卵巢癌的准确性，此外又分析了尿液中HE4水平和临床病理参数的关系；在体外，首先利用qRT-PCR和Westernblot检测HE4在卵巢癌细胞中的表达情况，另外构建HE4沉默表达载体，该表达载体经包装滴定后感染卵巢癌细胞OVCAR3、C13K，最后筛选得到HE4沉默的稳定卵巢癌细胞，利用MTT法、流式细胞术、划痕实验、Transwell小室和Westernblot检测了HE4沉默对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、EMT以及相关信号通路的影响；在体内，利用敲除HE4的卵巢癌细胞OVCAR3进行细胞移植构建了卵巢癌移植瘤裸鼠模型，并定期检测了敲除HE4对移植瘤体积和重量的影响，另外利用HE染色和免疫组化检测移植瘤中组织形态和HE4的表达情况，并利用Westernblot检测敲除HE4对移植瘤中相关信号通路的影响。本研究探讨了卵巢癌发病分子机制，为进一步提高诊治效果提供理论依据。为研究HE4对卵巢癌恶性生物学行为的调控作用及机制，本研究分为以下三部分进行展开研究：
第一部分：卵巢癌中HE4的表达分析；
第二部分：HE4沉默对卵巢癌细胞功能影响的研究；
第三部分：HE4沉默对卵巢癌裸鼠移植瘤生长的作用研究。
主要内容：
第一部分卵巢癌中HE4的表达分析
方法：
1.qRT-PCR、Westernblot和免疫组化检测HE4在卵巢癌组织中的表达情况。
2.LISA检测血清和尿液中HE4的水平，并分析血清HE4和尿液HE4水平的相关性。
3.用GraphPadprism5分析HE4在卵巢癌病人尿液中的水平与卵巢癌病人临床病理参数的关系。
结果：
1.与良性肿瘤组织和正常组织相比，HE4在卵巢癌组织中明显表达升高。与健康志愿者妇女、卵巢良性肿瘤妇女相比，HE4在卵巢癌妇女尿液和血清中的表达水平明显升高。
2.卵巢癌患者尿液HE4水平与血清HE4水平呈正相关，且ROC曲线结果显示尿液HE4与血清HE4诊断卵巢癌的价值都较高。
3.HE4在卵巢癌患者尿液中的水平与淋巴结有无转移和FIGO分期有显著相关性，而与年龄、组织类型以及肿瘤大小无相关性。
第二部分HE4沉默对卵巢癌细胞功能影响的研究
方法：
1.qRT-PCR检测HE4在卵巢癌细胞中的表达情况。
2.构建HE4敲除慢病毒载体，并对重组慢病毒进行包装和滴定，经感染卵巢癌细胞并筛选得到稳定细胞系，用于后续实验。
3.Westernblot检测HE4、凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、EMT标志性蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail以及JAK/STAT3信号通路相关蛋白JAK1、JAK2、p-JAK1、p-JAK2、STAT3、p-STAT3在卵巢癌细胞OVCAR3、C13K中的表达情况。
4.MTT法检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K增殖的影响。
5.流式细胞术检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K凋亡的影响。
6.划痕实验检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K侵袭的影响。
7.Transwell检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K迁移的影响。
结果：
1.与人正常卵巢表层上皮细胞HOSE相比，HE4在卵巢癌细胞株OVCAR3、C13K中表达明显升高。
2.经测序分析，pLenti-sh-HE4重组慢病毒构建成功。经病毒滴定测定，重组慢病毒滴定值为107.98TU/ml。将LV-sh-HE4感染卵巢癌细胞，得到HE4沉默的稳定细胞系。
3.HE4沉默能够抑制卵巢癌细胞OVCAR3、C13K的增殖以及Ki67的表达。
4.HE4沉默能够促进卵巢癌细胞OVCAR3、C13K的凋亡、Caspase-3的活性以及Cleaved-Caspase-3的表达。
5.HE4沉默能够抑制卵巢癌细胞OVCAR3、C13K的侵袭和迁移，以及MMP-2、MMP-9的表达。
6.HE4沉默能够促进卵巢癌细胞OVCAR3、C13K中E-cadherin的表达，并抑制N-cadherin、Snail的表达。
7.HE4沉默能够抑制卵巢癌细胞OVCAR3、C13K中JAK/STAT3信号通路相关蛋白p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3的表达，而JAK1、JAK2、STAT3表达无明显差异。
第三部分HE4沉默对卵巢癌裸鼠移植瘤生长的作用研究
方法：
1.利用敲除HE4的OVCAR3细胞进行构建卵巢癌移植瘤裸鼠模型，探讨HE4沉默对体内卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响。
2.利用HE染色检测HE4沉默对卵巢癌移植瘤组织形态的影响。
3.免疫组化检测卵巢癌移植瘤中HE4蛋白表达情况。
4.利用Westernblot检测移植瘤中JAK1、JAK2、p-JAK1、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表达情况。
结果
1.HE4沉默能够明显抑制移植瘤的生长。
2.HE染色发现，与对照组相比，HE4沉默组移植瘤组织恶性程度降低。
3.免疫组化结果显示，HE4沉默组卵巢癌移植瘤中HE4蛋白表达明显降低。
4.HE4沉默明显抑制卵巢癌移植瘤中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3的表达，而JAK1、JAK2、STAT3表达无明显差异。
全文结论：
1.与良性肿瘤组织和正常组织相比，HE4在卵巢癌组织中明显表达升高。与健康志愿者妇女、卵巢良性肿瘤妇女相比，HE4在卵巢癌妇女尿液和血清中的表达水平明显升高，并且卵巢癌患者尿液HE4水平与血清HE4水平呈正相关，ROC曲线结果显示与血清HE4一样。HE4在卵巢癌患者尿液中的水平与有无转移和FIGO分期有明显关系，尿液HE4对于卵巢癌的诊断价值也较高，且尿液取材方便快捷无创，有望应用于卵巢癌的临床诊断！
2.相较于HOSE细胞，HE4在卵巢癌细胞株OVCAR3、C13K中表达明显升高。细胞体外研究及裸鼠体内研究均表明，敲除HE4能通过抑制JAK/STAT3信号通路抑制卵巢癌细胞恶性生物学行为，降低移植瘤组织恶性程度，抑制移植瘤的生长。研究结果提示HE4/JAK/STAT3途径在卵巢癌的发生和发展过程中发挥着重要作用，有可能作为临床治疗卵巢癌的潜在靶标，为卵巢癌的治疗提供理论依据！
由于早期无明显临床症状，卵巢癌多见于晚期，主要筛查方法有经阴道超声、血清CA-125等。临床实践表明，这些方法存在一定的局限性。因此，当务之急是寻找可靠的肿瘤标志物用于卵巢癌的早期诊断和治疗。
人附睾蛋白4(Human epididymis protein 4，HE4)又名为WFDC2(WAP four-disulfide core protein 2)，主要表达于上呼吸道、肾脏远曲小管、生殖系统、结肠粘膜中，此外在卵巢组织中表达明显上调。HE4存在于血清、尿液和组织中，是新型的肿瘤标志物之一。在卵巢癌中研究发现，HE4沉默能够明显促进卵巢癌细胞凋亡、粘附，并能显著抑制细胞的增殖、侵袭、迁移以及移植瘤的生长。然而，HE4在卵巢癌中的具体作用机制还尚不清楚。
为研究HE4对卵巢癌恶性生物学行为的调控作用及机制，本研究首先在临床水平利用qRT-PCR、Westernblot和免疫组化检测了HE4在卵巢癌组织中的表达情况，又用ELISA检测了卵巢癌患者血清和尿液中HE4的表达情况，分析了血清HE4和尿液HE4水平的相关性以及二者诊断卵巢癌的准确性，此外又分析了尿液中HE4水平和临床病理参数的关系；在体外，首先利用qRT-PCR和Westernblot检测HE4在卵巢癌细胞中的表达情况，另外构建HE4沉默表达载体，该表达载体经包装滴定后感染卵巢癌细胞OVCAR3、C13K，最后筛选得到HE4沉默的稳定卵巢癌细胞，利用MTT法、流式细胞术、划痕实验、Transwell小室和Westernblot检测了HE4沉默对卵巢癌细胞增殖、凋亡、侵袭、迁移、EMT以及相关信号通路的影响；在体内，利用敲除HE4的卵巢癌细胞OVCAR3进行细胞移植构建了卵巢癌移植瘤裸鼠模型，并定期检测了敲除HE4对移植瘤体积和重量的影响，另外利用HE染色和免疫组化检测移植瘤中组织形态和HE4的表达情况，并利用Westernblot检测敲除HE4对移植瘤中相关信号通路的影响。本研究探讨了卵巢癌发病分子机制，为进一步提高诊治效果提供理论依据。为研究HE4对卵巢癌恶性生物学行为的调控作用及机制，本研究分为以下三部分进行展开研究：
第一部分：卵巢癌中HE4的表达分析；
第二部分：HE4沉默对卵巢癌细胞功能影响的研究；
第三部分：HE4沉默对卵巢癌裸鼠移植瘤生长的作用研究。
主要内容：
第一部分卵巢癌中HE4的表达分析
方法：
1.qRT-PCR、Westernblot和免疫组化检测HE4在卵巢癌组织中的表达情况。
2.LISA检测血清和尿液中HE4的水平，并分析血清HE4和尿液HE4水平的相关性。
3.用GraphPadprism5分析HE4在卵巢癌病人尿液中的水平与卵巢癌病人临床病理参数的关系。
结果：
1.与良性肿瘤组织和正常组织相比，HE4在卵巢癌组织中明显表达升高。与健康志愿者妇女、卵巢良性肿瘤妇女相比，HE4在卵巢癌妇女尿液和血清中的表达水平明显升高。
2.卵巢癌患者尿液HE4水平与血清HE4水平呈正相关，且ROC曲线结果显示尿液HE4与血清HE4诊断卵巢癌的价值都较高。
3.HE4在卵巢癌患者尿液中的水平与淋巴结有无转移和FIGO分期有显著相关性，而与年龄、组织类型以及肿瘤大小无相关性。
第二部分HE4沉默对卵巢癌细胞功能影响的研究
方法：
1.qRT-PCR检测HE4在卵巢癌细胞中的表达情况。
2.构建HE4敲除慢病毒载体，并对重组慢病毒进行包装和滴定，经感染卵巢癌细胞并筛选得到稳定细胞系，用于后续实验。
3.Westernblot检测HE4、凋亡相关蛋白cleavedcaspase-3、侵袭相关蛋白MMP-2、MMP-9、EMT标志性蛋白E-cadherin、N-cadherin、Snail以及JAK/STAT3信号通路相关蛋白JAK1、JAK2、p-JAK1、p-JAK2、STAT3、p-STAT3在卵巢癌细胞OVCAR3、C13K中的表达情况。
4.MTT法检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K增殖的影响。
5.流式细胞术检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K凋亡的影响。
6.划痕实验检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K侵袭的影响。
7.Transwell检测HE4沉默对卵巢癌细胞OVCAR3、C13K迁移的影响。
结果：
1.与人正常卵巢表层上皮细胞HOSE相比，HE4在卵巢癌细胞株OVCAR3、C13K中表达明显升高。
2.经测序分析，pLenti-sh-HE4重组慢病毒构建成功。经病毒滴定测定，重组慢病毒滴定值为107.98TU/ml。将LV-sh-HE4感染卵巢癌细胞，得到HE4沉默的稳定细胞系。
3.HE4沉默能够抑制卵巢癌细胞OVCAR3、C13K的增殖以及Ki67的表达。
4.HE4沉默能够促进卵巢癌细胞OVCAR3、C13K的凋亡、Caspase-3的活性以及Cleaved-Caspase-3的表达。
5.HE4沉默能够抑制卵巢癌细胞OVCAR3、C13K的侵袭和迁移，以及MMP-2、MMP-9的表达。
6.HE4沉默能够促进卵巢癌细胞OVCAR3、C13K中E-cadherin的表达，并抑制N-cadherin、Snail的表达。
7.HE4沉默能够抑制卵巢癌细胞OVCAR3、C13K中JAK/STAT3信号通路相关蛋白p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3的表达，而JAK1、JAK2、STAT3表达无明显差异。
第三部分HE4沉默对卵巢癌裸鼠移植瘤生长的作用研究
方法：
1.利用敲除HE4的OVCAR3细胞进行构建卵巢癌移植瘤裸鼠模型，探讨HE4沉默对体内卵巢癌裸鼠移植瘤生长的影响。
2.利用HE染色检测HE4沉默对卵巢癌移植瘤组织形态的影响。
3.免疫组化检测卵巢癌移植瘤中HE4蛋白表达情况。
4.利用Westernblot检测移植瘤中JAK1、JAK2、p-JAK1、p-JAK2、STAT3和p-STAT3的表达情况。
结果
1.HE4沉默能够明显抑制移植瘤的生长。
2.HE染色发现，与对照组相比，HE4沉默组移植瘤组织恶性程度降低。
3.免疫组化结果显示，HE4沉默组卵巢癌移植瘤中HE4蛋白表达明显降低。
4.HE4沉默明显抑制卵巢癌移植瘤中p-JAK1、p-JAK2、p-STAT3的表达，而JAK1、JAK2、STAT3表达无明显差异。
全文结论：
1.与良性肿瘤组织和正常组织相比，HE4在卵巢癌组织中明显表达升高。与健康志愿者妇女、卵巢良性肿瘤妇女相比，HE4在卵巢癌妇女尿液和血清中的表达水平明显升高，并且卵巢癌患者尿液HE4水平与血清HE4水平呈正相关，ROC曲线结果显示与血清HE4一样。HE4在卵巢癌患者尿液中的水平与有无转移和FIGO分期有明显关系，尿液HE4对于卵巢癌的诊断价值也较高，且尿液取材方便快捷无创，有望应用于卵巢癌的临床诊断！
2.相较于HOSE细胞，HE4在卵巢癌细胞株OVCAR3、C13K中表达明显升高。细胞体外研究及裸鼠体内研究均表明，敲除HE4能通过抑制JAK/STAT3信号通路抑制卵巢癌细胞恶性生物学行为，降低移植瘤组织恶性程度，抑制移植瘤的生长。研究结果提示HE4/JAK/STAT3途径在卵巢癌的发生和发展过程中发挥着重要作用，有可能作为临床治疗卵巢癌的潜在靶标，为卵巢癌的治疗提供理论依据！