水稻抗褐飞虱基因的挖掘及其表达分析

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水稻(Oryza sativaL.)是我国最重要的粮食作物之一,养活了我国65%以上的人口。褐飞虱(Nilaparvata lugens St?l)(BPH)携带多种水稻病毒,对水稻的安全生产危害巨大。化学杀虫剂滥用导致褐飞虱的抗性,使培育抗褐飞虱的水稻新品种逐渐成为防治水稻褐飞虱的最有效方法。得力于3K水稻基因组计划的贡献,有望从大量的水稻品种基因组挖掘到水稻抗褐飞虱基因。
  本文首先从美国国家生物技术信息中心(NCBI)网站旗下的序列读段档案馆(SRA)数据库下载21个对褐飞虱抗性能力不同的水稻品种基因组重测序数据。其中只有水稻品种TN1为褐飞虱敏感型品种,其余皆为褐飞虱抗性品种;也从GEO数据库中下载褐飞虱胁迫下褐飞虱敏感型水稻品种TN1和水稻褐飞虱抗性品种Rathu Heenati(RHT)的基因表达芯片数据。将比较基因组学和比较转录组学有机结合挖掘水稻抗褐飞虱基因、分析表达模式,具体内容如下所述。
  1.从水稻褐飞虱抗性品种基因组中挖掘得到水稻潜在抗褐飞虱基因
  本文以水稻品种日本晴的基因组为参考基因组,将褐飞虱敏感型品种TN1和另外20个水稻褐飞虱抗性品种的基因组重测序数据一一比对到参考基因组上,再分别检查基因组中的单核苷酸多态性(SingleNucleotide Polymorphisms,SNPs),其中在TN1基因组中检测到2176770个高质量的SNPs,在20个抗褐飞虱组水稻品种基因组中共检测到了5723365个的高质量SNPs,选取抗褐飞虱组水稻特异于褐飞虱敏感型水稻的3804138个SNP进行后续分析。通过软件SnpEff对SNPs位点进行注释,筛选出非同义突变(non-synonymous SNPs,nsSNPs)和无义突变(nonsense SNPs),这两种突变会导致基因编码氨基酸的改变。最后,筛选得到120个在20个水稻褐飞虱抗性品种中共同存在的nsSNPs,映射到79个基因中;筛选得到2个在20个水稻褐飞虱抗性品种中共同存在的无义SNPs,映射到2个基因中。去除重复基因后共挖掘获得有80个基因,称为“20个抗性水稻品种中共有的潜在抗褐飞虱基因”,而其中的120个nsSNPs和2个无义SNPs称为“20个抗性水稻品种中共有的潜在抗褐飞虱SNPs”。
  2.从褐飞虱胁迫下水稻转录组数据中挖掘水稻受褐飞虱胁迫诱导表达的基因
  由NCBI的GEO数据库下载褐飞虱胁迫下褐飞虱敏感型水稻品种TN1和水稻褐飞虱抗性品种RHT的基因表达的芯片数据,应用基因芯片分析技术,获得褐飞虱胁迫下水稻品种TN1和RHT的差异表达基因。在褐飞虱胁迫24h下,TN1中有4376个差异表达基因,其中2074个基因上调表达,2302个基因下调表达。同时,在褐飞虱胁迫24h下水稻褐飞虱抗性品种RHT中有1521个差异表达基因,894个基因上调表达,627个基因下调表达。然后,发现水稻品种TN1在褐飞虱胁迫下特有的差异表达基因有3043个,水稻品种RHT在褐飞虱胁迫下特有的差异表达基因只有188个,表明褐飞虱抗性能力不同的水稻品种应对褐飞虱的抵御机理存在差异。GO注释结果发现,RHT独有的上调表达基因主要集中在囊泡,可能是因为褐飞虱胁迫激发水稻内部代谢产物增加,细胞内分子运输功能增强,增加抗逆代谢产物的产生而获得抗褐飞虱能力。
  3.挖掘到水稻中具有抗褐飞虱SNPs又受褐飞虱胁迫诱导表达的基因
  本研究发现,供试20个水稻褐飞虱抗性品种的Os01g0602400基因共有一个相对于褐飞虱敏感型水稻品种TN1的nsSNP位点(基因核苷酸序列第466位的胞嘧啶C突变为胸腺嘧啶T,记为C466T)。且在褐飞虱胁迫下,水稻褐飞虱抗性品种RHT中Os01g0602400基因上调表达3.94倍。由于nsSNP使Os01g0602400基因产物的氨基酸序列中的第156位氨基酸由脯氨酸突变成丝氨酸,突变后该位点增加一个氢键作用,导致Os01g0602400基因产物的蛋白质结构功能发生变化,可能促进水稻叶片脱落酸积累,从而对褐飞虱表现出抗性。
  本文从基因组重测序数据和转录组数据出发,比较水稻褐飞虱敏感型品种TN1和水稻褐飞虱抗性品种组间的SNPs,挖掘出水稻潜在抗褐飞虱基因;也利用基因表达芯片分析技术获得褐飞虱胁迫下水稻褐飞虱抗性品种RHT和水稻褐飞虱敏感型品种TN1两者分别的差异表达基因,挖掘到褐飞虱胁迫下诱导上调表达的基因;最后,还挑选出既存在抗褐飞虱nsSNPs又受褐飞虱诱导上调表达的基因。本文为水稻抗褐飞虱研究提供了宝贵的基因资源,也为后续的基因功能试验验证点出目标。
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