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Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(KunitzTrypsinInhibitor，KTI)是一类对胰蛋白酶有抑制作用的蛋白酶抑制剂。20世纪40年代，Kunitz等人从牛的胰腺中提取出最早的KTI，通过研究发现KTI在动植物和微生物中都普遍存在。KTI因其特殊的结构功能特性而在抗虫基因工程领域研究广泛，当KTI被昆虫摄食并在体内积累时，它会通过抑制肠道内蛋白水解酶的活性，刺激消化酶的过量合成和分泌，从而引起某些必需氨基酸(如甲硫氨酸)的缺乏，扰乱昆虫的正常代谢，最终导致昆虫发育不正常甚至死亡。因此，植物在抵御害虫和病原体时，胰蛋白酶抑制剂发挥了十分重要的作用。通过对决明胰蛋白酶抑制剂(Cassia obtusifolia trypsin inhibitor，CoTI)的结构生物学研究，我们可以了解CoTI的结构特征，进而了解CoTI调控菜青虫中肠消化酶合成的分子机制，这在抗虫基因工程中具有重要的意义。
首先，本实验利用前期实验室保存的pET28TEV-CoTI重组大肠杆菌表达载体，通过原核诱导表达纯化，成功获得了重组蛋白，并经蛋白质质谱鉴定为CoTI蛋白。通过体外抑制活性实验测定了CoTI对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和凝血酶的抑制活性，结果发现CoTI对胰蛋白酶具有较强的抑制活性，而对胰凝乳蛋白酶和凝血酶基本没有抑制活性。又利用亲和电泳实验分别检测了CoTI与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶形成复合物的情况，结果验证了CoTI为特异性胰蛋白酶抑制剂。利用悬滴气相扩散法进行蛋白结晶，并对结晶条件进行初筛和优化。最终获得了硒代甲硫氨酸的CoTI晶体，使用X射线对CoTI晶体结构进行衍射，并使用单波长异常色散(SAD)收集数据，成功解析出CoTI三维晶体结构。CoTI的晶体结构属于正交晶体空间群P212121，每个不对称单元具有四个分子，形成两个相同的二聚体，分辨率为1.90?(PDB ID: 6KV2)，Rwork为18.60%，Rfree(对于自由R因子)为22.11%。
其次，分析CoTI三维晶体结构发现，CoTI晶体结构属于β-三叶草型，由12个反向平行β-折叠、2个螺旋和15个loop组成。CoTIβ-三叶草为伪三重重复对称结构，分别称为SubdomainI，SubdomainⅡ和SubdomainⅢ。CoTI的反应位点环为Loop5，从Ala83(P4)到残基Ileu90(P4)。通过构建CoTI-Trypsin复合物，我们发现Arg86作为CoTI的P1位点，在与胰蛋白酶的反应中伸入到胰蛋白酶的底物口袋，主要与胰蛋白酶的Asp189残基形成氢键。而在胰凝乳蛋白酶中，Asp189被替换成了极性的Ser，破坏了抑制剂和酶的氢键网络，导致CoTI对胰凝乳蛋白酶基本没有抑制活性。凝血酶中的Gln替代了胰蛋白酶中的Tyr151，可能导致异常的氢键形成。更重要的是，凝血酶本身与大分子底物相互作用主要是Tyr60A-Pro60B-Pro60C-Trp60D周围的特征环，而CoTI的反应位点环将与凝血酶的狭窄活性位点裂缝严重冲突，特别是与独特的Y60A-W60D。这可能会降低抑制剂和酶的表面互补性，导致CoTI对凝血酶没有抑制活性。对包括Kunitz家族、白细胞介素、成纤维细胞生长因子、凝集素等三叶草蛋白家族氨基酸序列进行比对分析，结果发现：Phe100、Trp114、Phe139在KTI中具有高度的保守性，推测对于结构维持和发挥抑制功能具有重要的作用。而Arg86在抑制活性中被认定为P1残基，推测对抑制活性具有重要的作用。然后，我们通过定点突变实验获得了R86E、F100A、W114A、F139A四个突变体蛋白，并分别测定了其对牛胰蛋白酶和菜青虫中肠蛋白酶的抑制活性，结果表明：与野生型CoTI相比，W114A，R86E，F139A和F100A对牛胰蛋白酶的抑制活性分别降低了63.4%、95.8%、30.3%、15%，对菜青虫中肠胰蛋白酶的抑制活性分别降低了62%，95%，35%和6.2%。结合CoTI和突变体的荧光光谱检测结果，表明CoTI的P1残基为Arg86，β桶的疏水包装W114、F100和F139对于维持蛋白本身稳定和发挥抑制活性至关重要。
基于保守的催化三联体残基和主要底物结合口袋(残基189，216和226)从菜青虫全基因组中成功鉴定出63个胰蛋白酶和11个胰凝乳蛋白酶。基于菜青虫中肠响应CoTI的转录组数据，从mRNA表达水平下降的丝氨酸蛋白酶中筛选到唯一的胰蛋白酶样蛋白酶PrSP40。因此，PrSP40被认为是CoTI的潜在靶蛋白酶。利用同源建模技术成功获得了PrSP40的三维结构，并将该结构用于和CoTI晶体结构对接和模拟实验，分析结果表明，PrSP40可能是CoTI抑制的菜青虫中肠蛋白酶，并且可能成为将来控制昆虫抗药性的候选目标。
首先，本实验利用前期实验室保存的pET28TEV-CoTI重组大肠杆菌表达载体，通过原核诱导表达纯化，成功获得了重组蛋白，并经蛋白质质谱鉴定为CoTI蛋白。通过体外抑制活性实验测定了CoTI对胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶和凝血酶的抑制活性，结果发现CoTI对胰蛋白酶具有较强的抑制活性，而对胰凝乳蛋白酶和凝血酶基本没有抑制活性。又利用亲和电泳实验分别检测了CoTI与胰蛋白酶、胰凝乳蛋白酶、凝血酶形成复合物的情况，结果验证了CoTI为特异性胰蛋白酶抑制剂。利用悬滴气相扩散法进行蛋白结晶，并对结晶条件进行初筛和优化。最终获得了硒代甲硫氨酸的CoTI晶体，使用X射线对CoTI晶体结构进行衍射，并使用单波长异常色散(SAD)收集数据，成功解析出CoTI三维晶体结构。CoTI的晶体结构属于正交晶体空间群P212121，每个不对称单元具有四个分子，形成两个相同的二聚体，分辨率为1.90?(PDB ID: 6KV2)，Rwork为18.60%，Rfree(对于自由R因子)为22.11%。
其次，分析CoTI三维晶体结构发现，CoTI晶体结构属于β-三叶草型，由12个反向平行β-折叠、2个螺旋和15个loop组成。CoTIβ-三叶草为伪三重重复对称结构，分别称为SubdomainI，SubdomainⅡ和SubdomainⅢ。CoTI的反应位点环为Loop5，从Ala83(P4)到残基Ileu90(P4)。通过构建CoTI-Trypsin复合物，我们发现Arg86作为CoTI的P1位点，在与胰蛋白酶的反应中伸入到胰蛋白酶的底物口袋，主要与胰蛋白酶的Asp189残基形成氢键。而在胰凝乳蛋白酶中，Asp189被替换成了极性的Ser，破坏了抑制剂和酶的氢键网络，导致CoTI对胰凝乳蛋白酶基本没有抑制活性。凝血酶中的Gln替代了胰蛋白酶中的Tyr151，可能导致异常的氢键形成。更重要的是，凝血酶本身与大分子底物相互作用主要是Tyr60A-Pro60B-Pro60C-Trp60D周围的特征环，而CoTI的反应位点环将与凝血酶的狭窄活性位点裂缝严重冲突，特别是与独特的Y60A-W60D。这可能会降低抑制剂和酶的表面互补性，导致CoTI对凝血酶没有抑制活性。对包括Kunitz家族、白细胞介素、成纤维细胞生长因子、凝集素等三叶草蛋白家族氨基酸序列进行比对分析，结果发现：Phe100、Trp114、Phe139在KTI中具有高度的保守性，推测对于结构维持和发挥抑制功能具有重要的作用。而Arg86在抑制活性中被认定为P1残基，推测对抑制活性具有重要的作用。然后，我们通过定点突变实验获得了R86E、F100A、W114A、F139A四个突变体蛋白，并分别测定了其对牛胰蛋白酶和菜青虫中肠蛋白酶的抑制活性，结果表明：与野生型CoTI相比，W114A，R86E，F139A和F100A对牛胰蛋白酶的抑制活性分别降低了63.4%、95.8%、30.3%、15%，对菜青虫中肠胰蛋白酶的抑制活性分别降低了62%，95%，35%和6.2%。结合CoTI和突变体的荧光光谱检测结果，表明CoTI的P1残基为Arg86，β桶的疏水包装W114、F100和F139对于维持蛋白本身稳定和发挥抑制活性至关重要。
基于保守的催化三联体残基和主要底物结合口袋(残基189，216和226)从菜青虫全基因组中成功鉴定出63个胰蛋白酶和11个胰凝乳蛋白酶。基于菜青虫中肠响应CoTI的转录组数据，从mRNA表达水平下降的丝氨酸蛋白酶中筛选到唯一的胰蛋白酶样蛋白酶PrSP40。因此，PrSP40被认为是CoTI的潜在靶蛋白酶。利用同源建模技术成功获得了PrSP40的三维结构，并将该结构用于和CoTI晶体结构对接和模拟实验，分析结果表明，PrSP40可能是CoTI抑制的菜青虫中肠蛋白酶，并且可能成为将来控制昆虫抗药性的候选目标。