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D-塔格糖甜度高、能量低，具有抗龋齿、改善肠道菌群、预防结肠癌、治疗Ⅱ型糖尿病等诸多益生作用，作为一种新型甜味剂和药物辅料广泛应用于食品、药品等领域。目前D-塔格糖生产主要有化学合成法和生物催化法，其中生物催化法因其副产物少、产物易于提纯等优点，成为目前的研究热点。L-阿拉伯糖异构酶(L-arabinose isomerase，L-AI)是生物催化法中最常用的酶，该酶可将L-阿拉伯糖转化为L-核酮糖，也可将D-半乳糖异构化为D-塔格糖。乳酸菌(lactic acid bacteria，LAB)作为食品级安全(Generally Recognized as safe，GRAS)菌株，具有许多益生特性，广泛应用于食品和药品行业，还作为细胞工厂来生产治疗性抗原、蛋白和肽类等医用分子。因此，利用乳酸菌表达本源或异源的L-AI可有效生产食品级D-塔格糖。
本文首先筛选了一株高产L-AI乳酸菌菌株，优化了其产酶培养基;通过酶学性质分析，优化纯酶的反应条件;利用生物信息学技术进行同源模建，确定L-AI的活性位点及底物结合相关位点后，进行定向突变，获得对底物D-半乳糖亲和力更强的突变体;将突变酶基因转入乳酸菌中进行表达，筛选具有高L-AI活性的重组乳杆菌，并对其进行固定化处理，测定对D-半乳糖的转化效率。具体研究内容及结果如下:
1.L-AI高产菌株的筛选及其产酶条件优化
利用选择培养基和半胱氨酸-咔唑显色法从实验室保藏的菌株中筛选出4株具有L-AI活性的乳酸菌，通过复筛，确定菌株LactobacillusreuteriSDMCC050455的酶活性最高。以该菌株的静息细胞作为催化剂，测定其催化性质，结果表明该细胞最适反应温度为60℃，最适pH为6.0-7.5;在65℃下处理1h后酶活没有显著降低，70℃下处理1h后酶活保留30％，高温下稳定性较好;pH为4.0-10.0时，酶活性稳定。此外，Co2+和Ni2+对其催化活性有促进作用，且Co2+促进作用更强。为了进一步提高Lb.reuteriSDMCC050455全细胞的L-AI催化活性，对其培养基成分、发酵条件、静息细胞处理方式进行了优化，结果表明最适菌体制备条件为:在培养基中添加3g/LL-阿拉伯糖同时作为碳源和诱导剂，于37℃下培养10h后收集菌体，并用0.02％的SDS处理菌体细胞1h。以2％(w/v)D-半乳糖为底物，将上述菌体细胞于最适条件下反应，酶活从6.55±0.19U/mL提升到15.07±0.28U/mL，提高到原来的2.30倍。
2.L-AI的酶学性质研究
为了研究菌株Lb.reuteriSDMCC050455产生的L-AI酶学性质，从该菌株的全基因组上通过PCR技术克隆了araA基因。测序发现，该基因大小1422bp，编码473个氨基酸，蛋白分子量为53.8kDa，等电点为5.13。将其与大肠杆菌表达载体pETDuet-1连接，转化EcoliBL21(DE3)，利用诱导表达和镍离子亲和层析获得纯化蛋白L-AI。经测定，以D-半乳糖为底物时，该酶的Km值为746.37mM，Vmax为0.28μmol·min-1·mg-1，酶活力为0.26U/mg。酶学性质表明，该酶最适反应温度为60℃，最适pH为6.5;在60℃处理1h后酶活性可保持86％的，65℃处理1h后酶活性仍能保持76％，但在70℃下处理20min后酶活基本丧失，高温下其稳定性下降;pH为7.0-8.5时酶活性稳定。此外，金属离子对酶活性的影响不同，其中Co2+和Mn2+促进作用最为明显，且Co2+促进作用更强。
3.定点突变提高L-AI对底物D-半乳糖的亲和力
为了提高LRAI对半乳糖的底物亲和力，通过Swiss-Model网站对其氨基酸序列进行同源建模得到其三维结构，并利用Pymol软件、ClustalOmega和ESPript3.0在线软件对其结构进行比对，确定可能对底物与活性中心结合有影响的4个氨基酸位点是:Phe278、Ser310、Lys422和Arg437，并对以上位点进行丙氨酸扫描，通过PCR反应和大肠杆菌异源表达获得4个突变体蛋白:F278A、S310A、K422A和R437A。
测定以上4个蛋白的酶学性质和酶动力学参数，结果发现，K422A的Km值最低，为341.30mM，较野生型LRAI的对底物D-半乳糖的亲和力增强;Vmax为0.57μmol·min-1·mg-1;酶活力为0.50U/mg，较野生型提高了91.89％。酶学性质表明，K422A的最适反应温度为70℃，较野生型有显著提高;最适反应pH为6.5，与野生型一致;在70℃下处理1h后仍能保持75％以上的活性，热稳定性较野生型显著提高;在pH为6.0-9.0的范围内稳定性较高，pH耐受范围较野生型增大，且对低pH的耐受性较野生型增强。
4.L-AI在乳杆菌中的克隆与表达
D-塔格糖可以在酸性环境中稳定存在(pH 3-7)，因而利用乳酸菌作为全细胞催化剂对于D-塔格糖的生产具有应用潜力。本文克隆了Lb.reuteriSDMCC050455的L-AI基因araA及其定点突变体K422A的基因maraA3，分别与表达载体pCD4033连接，构建重组载体并转化至Lb.brevisATCC367，得到重组菌株Lb.brevisATCC367/pCD4033-araA(LBW)和Lb.brevisATCC367/pCD4033-maraA3(LBM)。通过L-AI酶活性测定发现两株重组菌静息细胞最适反应温度均为65-70℃，最适pH为6.0-8.0;在70℃下处理1h后LBM仍能保持73％以上的酶活性，但LBW仅能保持34％的活性，故菌株LBM在高温下稳定性较LBW更强;pH为4.0-10.0条件下两菌株酶活性稳定。不同金属离子对两菌株的L-AI酶活影响不同，1mMCo2+对两菌株的L-AI酶活具有促进作用，且对LBM的促进作用更加明显。
LBM在最适条件下反应，酶活为40.49±3.60U/mL，较Lb.reuteriSDMCC050455提高了1.69倍。因此，LBM更适合用于生产D-塔格糖。研究LBM对不同底物浓度的转化率发现，以150g/L的D-半乳糖为底物，反应24h后转化率达到25.06％，D-塔格糖的生成总量为37.60g/L，产物生成速率为1.57g/L/h。
利用海藻酸钙包埋法将LBM菌株固定化处理，最终确定最佳的海藻酸钠浓度为1％，CaCl2浓度为5％，最适缓冲液为硼酸盐缓冲液。固定化细胞以350g/LD-半乳糖为底物反应24h后，D-塔格糖生成总量达到46.85g/L，此时产物生成率为1.95g/L/h，D-半乳糖转化率为13.39％。
5.L-AI在嗜热链球菌中的应用
嗜热链球菌是一种嗜热革兰氏阳性乳酸菌，与德氏乳杆菌共同用于酸奶、奶酪的发酵。本文克隆了Lb.reuteriSDMCC050455的L-AI基因araA与表达载体pLEISS-P59连接，构建重组载体并转化至StreptococcusthermophilusST1中，得到重组菌株St.thermophilusST1/pLEISS-P59-araA(STW2)。制备静息细胞在该酶的最适反应温度60℃下反应1h，利用半胱氨酸-咔唑法测定L-AI酶活性，结果显示重组菌株STW2中成功表达L-AI，具有较强的L-AI酶活性。之后为了模拟牛乳发酵环境，将STW2接种至含5％乳糖的培养基中于42℃发酵12h后，利用薄层层析法检测发酵液中D-塔格糖的生成，结果显示，发酵60h后依然未观察到明显的D-塔格糖的条带。可能是由于发酵温度低于酶的最适反应温度，L-AI酶活力低下;此外，嗜热链球菌表达外源蛋白能力较弱，可能L-AI表达量较少，因而活力较弱。对于发酵乳制品中的D-半乳糖转化为D-塔格糖的研究有待进一步探索。
本文首先筛选了一株高产L-AI乳酸菌菌株，优化了其产酶培养基;通过酶学性质分析，优化纯酶的反应条件;利用生物信息学技术进行同源模建，确定L-AI的活性位点及底物结合相关位点后，进行定向突变，获得对底物D-半乳糖亲和力更强的突变体;将突变酶基因转入乳酸菌中进行表达，筛选具有高L-AI活性的重组乳杆菌，并对其进行固定化处理，测定对D-半乳糖的转化效率。具体研究内容及结果如下:
1.L-AI高产菌株的筛选及其产酶条件优化
利用选择培养基和半胱氨酸-咔唑显色法从实验室保藏的菌株中筛选出4株具有L-AI活性的乳酸菌，通过复筛，确定菌株LactobacillusreuteriSDMCC050455的酶活性最高。以该菌株的静息细胞作为催化剂，测定其催化性质，结果表明该细胞最适反应温度为60℃，最适pH为6.0-7.5;在65℃下处理1h后酶活没有显著降低，70℃下处理1h后酶活保留30％，高温下稳定性较好;pH为4.0-10.0时，酶活性稳定。此外，Co2+和Ni2+对其催化活性有促进作用，且Co2+促进作用更强。为了进一步提高Lb.reuteriSDMCC050455全细胞的L-AI催化活性，对其培养基成分、发酵条件、静息细胞处理方式进行了优化，结果表明最适菌体制备条件为:在培养基中添加3g/LL-阿拉伯糖同时作为碳源和诱导剂，于37℃下培养10h后收集菌体，并用0.02％的SDS处理菌体细胞1h。以2％(w/v)D-半乳糖为底物，将上述菌体细胞于最适条件下反应，酶活从6.55±0.19U/mL提升到15.07±0.28U/mL，提高到原来的2.30倍。
2.L-AI的酶学性质研究
为了研究菌株Lb.reuteriSDMCC050455产生的L-AI酶学性质，从该菌株的全基因组上通过PCR技术克隆了araA基因。测序发现，该基因大小1422bp，编码473个氨基酸，蛋白分子量为53.8kDa，等电点为5.13。将其与大肠杆菌表达载体pETDuet-1连接，转化EcoliBL21(DE3)，利用诱导表达和镍离子亲和层析获得纯化蛋白L-AI。经测定，以D-半乳糖为底物时，该酶的Km值为746.37mM，Vmax为0.28μmol·min-1·mg-1，酶活力为0.26U/mg。酶学性质表明，该酶最适反应温度为60℃，最适pH为6.5;在60℃处理1h后酶活性可保持86％的，65℃处理1h后酶活性仍能保持76％，但在70℃下处理20min后酶活基本丧失，高温下其稳定性下降;pH为7.0-8.5时酶活性稳定。此外，金属离子对酶活性的影响不同，其中Co2+和Mn2+促进作用最为明显，且Co2+促进作用更强。
3.定点突变提高L-AI对底物D-半乳糖的亲和力
为了提高LRAI对半乳糖的底物亲和力，通过Swiss-Model网站对其氨基酸序列进行同源建模得到其三维结构，并利用Pymol软件、ClustalOmega和ESPript3.0在线软件对其结构进行比对，确定可能对底物与活性中心结合有影响的4个氨基酸位点是:Phe278、Ser310、Lys422和Arg437，并对以上位点进行丙氨酸扫描，通过PCR反应和大肠杆菌异源表达获得4个突变体蛋白:F278A、S310A、K422A和R437A。
测定以上4个蛋白的酶学性质和酶动力学参数，结果发现，K422A的Km值最低，为341.30mM，较野生型LRAI的对底物D-半乳糖的亲和力增强;Vmax为0.57μmol·min-1·mg-1;酶活力为0.50U/mg，较野生型提高了91.89％。酶学性质表明，K422A的最适反应温度为70℃，较野生型有显著提高;最适反应pH为6.5，与野生型一致;在70℃下处理1h后仍能保持75％以上的活性，热稳定性较野生型显著提高;在pH为6.0-9.0的范围内稳定性较高，pH耐受范围较野生型增大，且对低pH的耐受性较野生型增强。
4.L-AI在乳杆菌中的克隆与表达
D-塔格糖可以在酸性环境中稳定存在(pH 3-7)，因而利用乳酸菌作为全细胞催化剂对于D-塔格糖的生产具有应用潜力。本文克隆了Lb.reuteriSDMCC050455的L-AI基因araA及其定点突变体K422A的基因maraA3，分别与表达载体pCD4033连接，构建重组载体并转化至Lb.brevisATCC367，得到重组菌株Lb.brevisATCC367/pCD4033-araA(LBW)和Lb.brevisATCC367/pCD4033-maraA3(LBM)。通过L-AI酶活性测定发现两株重组菌静息细胞最适反应温度均为65-70℃，最适pH为6.0-8.0;在70℃下处理1h后LBM仍能保持73％以上的酶活性，但LBW仅能保持34％的活性，故菌株LBM在高温下稳定性较LBW更强;pH为4.0-10.0条件下两菌株酶活性稳定。不同金属离子对两菌株的L-AI酶活影响不同，1mMCo2+对两菌株的L-AI酶活具有促进作用，且对LBM的促进作用更加明显。
LBM在最适条件下反应，酶活为40.49±3.60U/mL，较Lb.reuteriSDMCC050455提高了1.69倍。因此，LBM更适合用于生产D-塔格糖。研究LBM对不同底物浓度的转化率发现，以150g/L的D-半乳糖为底物，反应24h后转化率达到25.06％，D-塔格糖的生成总量为37.60g/L，产物生成速率为1.57g/L/h。
利用海藻酸钙包埋法将LBM菌株固定化处理，最终确定最佳的海藻酸钠浓度为1％，CaCl2浓度为5％，最适缓冲液为硼酸盐缓冲液。固定化细胞以350g/LD-半乳糖为底物反应24h后，D-塔格糖生成总量达到46.85g/L，此时产物生成率为1.95g/L/h，D-半乳糖转化率为13.39％。
5.L-AI在嗜热链球菌中的应用
嗜热链球菌是一种嗜热革兰氏阳性乳酸菌，与德氏乳杆菌共同用于酸奶、奶酪的发酵。本文克隆了Lb.reuteriSDMCC050455的L-AI基因araA与表达载体pLEISS-P59连接，构建重组载体并转化至StreptococcusthermophilusST1中，得到重组菌株St.thermophilusST1/pLEISS-P59-araA(STW2)。制备静息细胞在该酶的最适反应温度60℃下反应1h，利用半胱氨酸-咔唑法测定L-AI酶活性，结果显示重组菌株STW2中成功表达L-AI，具有较强的L-AI酶活性。之后为了模拟牛乳发酵环境，将STW2接种至含5％乳糖的培养基中于42℃发酵12h后，利用薄层层析法检测发酵液中D-塔格糖的生成，结果显示，发酵60h后依然未观察到明显的D-塔格糖的条带。可能是由于发酵温度低于酶的最适反应温度，L-AI酶活力低下;此外，嗜热链球菌表达外源蛋白能力较弱，可能L-AI表达量较少，因而活力较弱。对于发酵乳制品中的D-半乳糖转化为D-塔格糖的研究有待进一步探索。