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二甲基硫(dimethysulfide，DMS)是海洋中最丰富的挥发硫形态，在推动全球硫循环和可能影响气候方面发挥重要作用。它是排放到大气中的最丰富的天然硫化物，海洋向大气中转移的硫（以DMS的形式）约为每年13-37Tg。DMS排放不仅平衡全球硫收支，而且可能通过其在大气中的氧化产物影响地球气候。DMS的前体主要是二甲基巯基丙酸内盐(dimethylsulfoniopropionate，DMSP)。目前研究表明，DMS主要是海洋环境中DMSP通过微生物分解代谢产生的，但也可以由与DMSP无关的来源产生。研究表明，一些海洋和陆地的需氧细菌可以甲基化甲硫醇(methanethiol，MeSH)产生DMS，这种途径被称为依赖MeSH的DMS生成途径(MeSH-dependent DMS production，Mdd)，并且许多细菌中发现了Mdd的基因，称为mddA。MddA是一种结合在膜上的依赖S-腺苷甲硫氨酸(SAM)的一种甲基转移酶，它使MeSH发生甲基化，产生DMS。在本论文中，我们以来自细菌来源的MddA为研究对象，对四种MddA蛋白进行了异源表达和纯化，对来自Pseudomonas deceptionensisM1T的MddA进行了详细的研究，对其生化特性进行了分析，并且预测了其三维结构，对MddA甲基化H2S的过程进行了深入的研究。
1.MddA的序列分析及表达纯化与酶学性质分析。
本研究中，我们合成了已报道的来自P.deceptionensisM1T的mddA序列及三个不同菌株来源的mddA的同源序列mddA-1，mddA-2，mddA-3，并对这四个MddA蛋白进行异源表达和纯化。我们对来自P.deceptionensisM1T的MddA进行了详细的研究，对其基本性质和酶动力学参数进行了测定。结果显示，MddA的最适酶活温度是30℃，MddA的最适酶活pH为8.0。酶动力学参数结果显示，MddA对H2S的Km值为0.41±0.04mM，比对MeSH的Km值（1.99±0.11mM）低近一个数量级。另外，MddA对MeSH的kcat值以及kcat/Km值比对H2S的均要高，这意味当以H2S为底物时，中间产物MeSH的消耗速率要高于其产生速率。因此在这两步甲基化中，中间产物MeSH不会大量累积。经过与其他硫醇S-甲基转移酶对H2S的动力学参数的比较，发现MddA对H2S具有较低的Km值和较高的催化效率。MddA对几种不同底物的动力学参数结果表明H2S是MddA的天然底物。
2.MddA的结构预测与催化机制分析。
虽然MddA可以以H2S为底物产生DMS，但是其催化机制尚不清楚。我们对MddA的结构进行了预测，发现了6个可能参与催化反应的氨基酸残基，并构建了对应的6个点突变体。结合结构预测和突变体分析，我们提出了MddA催化H2S甲基化可能的分子机制。MddA催化的反应是一个双分子亲核取代反应，在MddA反应中，H77充当催化碱的作用，从H2S夺取一个氢原子使得H2S去质子化并引发电子传递。之后H2S的硫原子攻击SAM的甲基，甲基转移到H2S的硫上，生成产物MeSH。之后，SAH从催化腔释放，SAM分子再次进入催化腔。77位的组氨酸再次作为催化碱，从MeSH夺取一个氢原子，使得MeSH去质子化并引发电子传递。之后MeSH的硫原子攻击SAM的甲基，甲基转移到MeSH的硫上，生成最终产物DMS。本章研究为更好的了解MddA的催化机制有重要意义。
综上所述，我们对MddA的酶学性质进行了研究，并提出了MddA催化H2S甲基化可能的分子机制。研究结果为不依赖DMSP产生DMS的过程进行了补充和完善，为进一步了解DMS的产生过程提供了重要信息。
1.MddA的序列分析及表达纯化与酶学性质分析。
本研究中，我们合成了已报道的来自P.deceptionensisM1T的mddA序列及三个不同菌株来源的mddA的同源序列mddA-1，mddA-2，mddA-3，并对这四个MddA蛋白进行异源表达和纯化。我们对来自P.deceptionensisM1T的MddA进行了详细的研究，对其基本性质和酶动力学参数进行了测定。结果显示，MddA的最适酶活温度是30℃，MddA的最适酶活pH为8.0。酶动力学参数结果显示，MddA对H2S的Km值为0.41±0.04mM，比对MeSH的Km值（1.99±0.11mM）低近一个数量级。另外，MddA对MeSH的kcat值以及kcat/Km值比对H2S的均要高，这意味当以H2S为底物时，中间产物MeSH的消耗速率要高于其产生速率。因此在这两步甲基化中，中间产物MeSH不会大量累积。经过与其他硫醇S-甲基转移酶对H2S的动力学参数的比较，发现MddA对H2S具有较低的Km值和较高的催化效率。MddA对几种不同底物的动力学参数结果表明H2S是MddA的天然底物。
2.MddA的结构预测与催化机制分析。
虽然MddA可以以H2S为底物产生DMS，但是其催化机制尚不清楚。我们对MddA的结构进行了预测，发现了6个可能参与催化反应的氨基酸残基，并构建了对应的6个点突变体。结合结构预测和突变体分析，我们提出了MddA催化H2S甲基化可能的分子机制。MddA催化的反应是一个双分子亲核取代反应，在MddA反应中，H77充当催化碱的作用，从H2S夺取一个氢原子使得H2S去质子化并引发电子传递。之后H2S的硫原子攻击SAM的甲基，甲基转移到H2S的硫上，生成产物MeSH。之后，SAH从催化腔释放，SAM分子再次进入催化腔。77位的组氨酸再次作为催化碱，从MeSH夺取一个氢原子，使得MeSH去质子化并引发电子传递。之后MeSH的硫原子攻击SAM的甲基，甲基转移到MeSH的硫上，生成最终产物DMS。本章研究为更好的了解MddA的催化机制有重要意义。
综上所述，我们对MddA的酶学性质进行了研究，并提出了MddA催化H2S甲基化可能的分子机制。研究结果为不依赖DMSP产生DMS的过程进行了补充和完善，为进一步了解DMS的产生过程提供了重要信息。