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尼古丁又称烟碱，是茄科烟草中最主要的生物碱。在人体中，尼古丁代谢产生的N-亚硝胺类物质易诱发多种疾病，同时通过刺激烟碱乙酰胆碱受体促使中枢神经系统释放大量神经递质，具有致癌性与致瘾性;在自然界中，香烟、含烟碱农药及杀虫剂等工厂肆意排放有毒残渣，其中尼古丁等杂环生物碱因难以降解而发生富集，严重污染环境且破坏生态平衡。因此，为实现尼古丁及其代谢产物的完全降解，研发高效无害的尼古丁降解新方法兼具生态效益和社会效益。尼古丁降解微生物能够以尼古丁为唯一碳源和氮源生长，在长期自然进化中形成了不同代谢机制，通过生物降解直接降低尼古丁含量。其中，细菌尼古丁代谢途径研究较为透彻，可分为以嗜烟碱节杆菌为代表的吡啶途径、以恶臭假单胞菌为代表的吡咯途径和以苍白杆菌为代表衍生于吡啶途径与吡咯途径的VPP途径;而真菌尼古丁代谢研究颇少，仅从石膏样小孢子菌（Microsporum gypseum）、刺孢小克银汉霉（Cunninghamella echinulata）、丝核隔膜真菌（Pellicularia filamentosa）和米曲霉（Aspergilus oryzae）中提出去甲基途径，并且仅报道了第一步尼古丁发生N-去甲基化生成去甲基尼古丁的反应，尼古丁完整代谢途径中关键酶基因及其催化机制尚不完全清楚。
本论文针对A.oryzae112822第一步尼古丁降解生成去甲基尼古丁的反应，对催化关键酶即NND候选基因cyp55a5v2、cyp620h1与cyp620h2以及细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450reductase，CPR)基因Ao.cpr进行序列分析，基因大小分别为1227bp、1578bp、1587bp和2088bp，含有20、23、20和26个氨基酸组成的预测N-信号肽以及3、0、2和3个预测N-糖基化位点。根据A.oryzae RIB40注释基因组(GenBank:GCA_000184455.3)设计引物并在起始密码子ATG前插入Kozak序列(GCCACC)以提高转录和翻译效率，以A.oryzae112822基因组为模板，PCR扩增获得去除预测信号肽的4个基因cyp55a5v2(1167bp)、cyp620h1nt(1509bp)、cyp620h2nt(1527bp)和Ao.cpr(2010bp)后，构建重组质粒pYES2-cyp55a5v2、pYES2-cyp620h1nt和pYES2-cyp620h2nt在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303中进行胞内可溶性表达，梯度离心所获微粒体沉淀SDS-PAGE后的Western-blotting检测到重组CYP55A5v2、CYP620H1nt和CYP620H2nt的分子量分别为～45kDa、～58kDa和～59kDa，分别与其理论分子量44.3kDa、57.8kDa和58.5kDa一致;同时构建重组质粒pPICzαA-Ao.cpr在毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71中进行胞内可溶性表达，分离纯化所获纯酶SDS-PAGE后的Western-blotting检测到重组Ao.CPR的分子量为～75kDa，与理论分子量73.9kDa一致。以200mM NaDPH为电子供体，以0.5mM马心细胞色素C(10mM KPB pH7.4)为电子受体，在波长550nm下检测到每μg重组Ao.CPR每分钟可生成1.5nmol的还原产物。在2mM NADPH、300μg重组Ao.CPR以及充足O2环境中，以0.2g/mL尼古丁(50mM KPB，pH7.5)为底物，28℃反应12h后，TLC和HPLC检测到重组CYP620H1nt微粒体表现出尼古丁降解活性，且出现迁移率和保留时间与去甲基尼古丁一致的催化产物;ESI-MS检测到该反应液中存在m/z为149.09的分子离子峰([M+H]+)，与去甲基尼古丁分子质量(148.10)一致，证明重组CYP620H1nt在重组Ao.CPR协助下具有NND活性，催化尼古丁N-去甲基反应。
CRISPR/Cas9基因编辑技术现已在真菌中成功应用，实现了基因的定向改造与遗传修饰。本实验室前期通过成功敲除A.oryzae112822体内调控色素合成的聚酮合成酶基因wA(GenBank:XM_001822648.1)证实了所构建的米曲霉CRISPR/Cas9系统具备基因的靶向编辑功能。本论文基于该系统对米曲霉体内NND候选基因cyp620h1进行靶向敲除，以pUC57载体为模板设计引物，PCR扩增插入5组不同sgRNA(20bp)的线性载体pUC57-△cyp620h1-sgRNA1/2/3/4/5;将酶切所得sgRNA读码框△cyp620h1-sgRNA1/2/3/4/5连接Cas9表达载体BPCF构建sgRNA-Cas9共表达载体BPCF-△cyp620h1-sgRNA1/2/3/4/5;同时以吡啶硫胺素(Pyrithiamine，PT)抗性基因（ptrA）作为筛选标记，构建由靶向基因cyp620h1上游同源臂(997bp)、ptrA基因(GenBank:AF217503.1，2028bp)与下游同源臂(1025bp)组成的同源修复模板(Homology-directed repair template)HDRT-ptrA。以1μg/mL PT为筛选条件，将PCR扩增所得HDRT-ptrA片段与线性化后的sgRNA-Cas9共表达载体在PEG介导下共同转化米曲霉原生质体;以2μg/mL PT为筛选条件，对长势良好的转化子多次传代直至基因组稳定;针对ptrA基因设计同源臂内引物，针对同源交换区段设计同源臂外引物，以米曲霉转化子基因组为模板进行表型筛选和PCR验证，成功获得cyp620h1被靶向敲除的抗PT米曲霉菌株(PTR)。后续还将通过比较原始菌株与pTR菌株尼古丁降解能力的差异，验证该候选CYP的NND催化活性。
A.oryzae112822降解尼古丁的中间产物NMN是一类典型的六元杂环化合物，其吡啶环由N-甲基烟酰胺羟化酶催化发生α-羟基化并生成2HNMN。据报道以钼辅因子为催化中心的钼喋呤羟化酶(Xanthine dehydrogenase，XDH)不受芳杂环化合物侧链的影响，能够特异结合α位发生亲核取代反应，且A.oryzae RIB40注释基因组中仅存在一个预测xdh基因(GenBank:XM_001820144.3)，因此推测该基因编码的XDH(GenBank:XP_001820196.1)具有N-甲基烟酰胺羟化酶的催化功能。本论文通过硫酸铵分级沉淀对5mM NMN诱导培养条件下所得A.oryzae112822细胞裂解液进行40～70％硫酸铵沉淀蛋白粗分级获得粗酶液。在5mM NAD+和充足O2环境中，以2mM NMN(50mM KPB，pH6.5)为底物，28℃反应12h后，TLC和HPLC检测到脱盐浓缩后的粗酶液对NMN发生降解，且ESI-MS检测到该反应液存在m/z为174.99的分子离子峰([M+Na]+)，与2HNMN分子质量(152.06)一致，证明该粗酶液具有N-甲基烟酰胺羟化酶的催化活性;在1mM MTT和0.1mM PMS存在下，以3mM次黄嘌呤(50mM Tris-HCl,pH8.0)为底物，Native gradient PAGE胶在避光条件下的活性染色检测到XDH活性，显色条带的分子量大小为～270kDa;将该条带切胶后进行肽指纹图谱分析，结果显示与来源于A.oryzae RIB40的XDH肽段匹配率最高为62.41％，推测切胶纯化酶为XDH。根据A.oryzae RIB40基因组中预测的xdh基因序列设计引物并在起始密码子ATG前插入Kozak序列，以A.oryzae112822基因组为模板PCR扩增获得xdh基因片段，核苷酸序列比对结果与预测xdh基因一致。该基因大小为4080bp，编码1359个氨基酸，存在7个预测N-糖基化位点。将扩增所得xdh基因片段构建重组质粒pPICzα-xdh并在P.pastoris KM71中进行胞内可溶性表达，分离纯化所获纯酶SDS-PAGE后的Western-blotting检测到重组XDH的单亚基分子量为～175kDa，N-糖苷内切酶PNGaseF切割糖链后的SDS-PAGE检测到去糖基化重组酶的单亚基分子量为～150kDa，与理论分子量(148.3kDa)一致，证明该重组酶发生N-糖基化修饰;Native gradient PAGE检测到该重组酶天然聚合体的分子量为～342kDa，证明该酶活性状态下为二聚体形式蛋白。在5mM NAD+和充足O2环境中，以1mM NMN(50mM KPB，pH6.5)为底物，28℃反应48h后，TLC检测到重组XDH降解NMN并形成新的产物;ESI-MS检测到该反应液存在m/z为174.99的分子离子峰([M+Na]+)，与2HNMN分子质量(152.06)一致，因此将来源于A.oryzae112822的XDH鉴定为具有N-甲基烟酰胺羟化酶活性的XDH。本部分研究结合NMN底物降解活性与XDH活性的测定，开创性地完成了该途径中N-甲基烟酰胺羟化酶的基因鉴定和异源表达。
本论文围绕尼古丁降解菌株A.oryzae112822去甲基降烟碱途径，研究了该途径代谢相关细胞色素P450单加氧酶CYP620H1nt的NND催化活性和钼喋呤羟化酶XDH的N-甲基烟酰胺羟化酶活性，为阐释真菌尼古丁代谢途径关键酶及其基因的分子机理提供了重要的基础。
本论文针对A.oryzae112822第一步尼古丁降解生成去甲基尼古丁的反应，对催化关键酶即NND候选基因cyp55a5v2、cyp620h1与cyp620h2以及细胞色素P450还原酶(Cytochrome P450reductase，CPR)基因Ao.cpr进行序列分析，基因大小分别为1227bp、1578bp、1587bp和2088bp，含有20、23、20和26个氨基酸组成的预测N-信号肽以及3、0、2和3个预测N-糖基化位点。根据A.oryzae RIB40注释基因组(GenBank:GCA_000184455.3)设计引物并在起始密码子ATG前插入Kozak序列(GCCACC)以提高转录和翻译效率，以A.oryzae112822基因组为模板，PCR扩增获得去除预测信号肽的4个基因cyp55a5v2(1167bp)、cyp620h1nt(1509bp)、cyp620h2nt(1527bp)和Ao.cpr(2010bp)后，构建重组质粒pYES2-cyp55a5v2、pYES2-cyp620h1nt和pYES2-cyp620h2nt在酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）W303中进行胞内可溶性表达，梯度离心所获微粒体沉淀SDS-PAGE后的Western-blotting检测到重组CYP55A5v2、CYP620H1nt和CYP620H2nt的分子量分别为～45kDa、～58kDa和～59kDa，分别与其理论分子量44.3kDa、57.8kDa和58.5kDa一致;同时构建重组质粒pPICzαA-Ao.cpr在毕赤酵母（Pichia pastoris）KM71中进行胞内可溶性表达，分离纯化所获纯酶SDS-PAGE后的Western-blotting检测到重组Ao.CPR的分子量为～75kDa，与理论分子量73.9kDa一致。以200mM NaDPH为电子供体，以0.5mM马心细胞色素C(10mM KPB pH7.4)为电子受体，在波长550nm下检测到每μg重组Ao.CPR每分钟可生成1.5nmol的还原产物。在2mM NADPH、300μg重组Ao.CPR以及充足O2环境中，以0.2g/mL尼古丁(50mM KPB，pH7.5)为底物，28℃反应12h后，TLC和HPLC检测到重组CYP620H1nt微粒体表现出尼古丁降解活性，且出现迁移率和保留时间与去甲基尼古丁一致的催化产物;ESI-MS检测到该反应液中存在m/z为149.09的分子离子峰([M+H]+)，与去甲基尼古丁分子质量(148.10)一致，证明重组CYP620H1nt在重组Ao.CPR协助下具有NND活性，催化尼古丁N-去甲基反应。
CRISPR/Cas9基因编辑技术现已在真菌中成功应用，实现了基因的定向改造与遗传修饰。本实验室前期通过成功敲除A.oryzae112822体内调控色素合成的聚酮合成酶基因wA(GenBank:XM_001822648.1)证实了所构建的米曲霉CRISPR/Cas9系统具备基因的靶向编辑功能。本论文基于该系统对米曲霉体内NND候选基因cyp620h1进行靶向敲除，以pUC57载体为模板设计引物，PCR扩增插入5组不同sgRNA(20bp)的线性载体pUC57-△cyp620h1-sgRNA1/2/3/4/5;将酶切所得sgRNA读码框△cyp620h1-sgRNA1/2/3/4/5连接Cas9表达载体BPCF构建sgRNA-Cas9共表达载体BPCF-△cyp620h1-sgRNA1/2/3/4/5;同时以吡啶硫胺素(Pyrithiamine，PT)抗性基因（ptrA）作为筛选标记，构建由靶向基因cyp620h1上游同源臂(997bp)、ptrA基因(GenBank:AF217503.1，2028bp)与下游同源臂(1025bp)组成的同源修复模板(Homology-directed repair template)HDRT-ptrA。以1μg/mL PT为筛选条件，将PCR扩增所得HDRT-ptrA片段与线性化后的sgRNA-Cas9共表达载体在PEG介导下共同转化米曲霉原生质体;以2μg/mL PT为筛选条件，对长势良好的转化子多次传代直至基因组稳定;针对ptrA基因设计同源臂内引物，针对同源交换区段设计同源臂外引物，以米曲霉转化子基因组为模板进行表型筛选和PCR验证，成功获得cyp620h1被靶向敲除的抗PT米曲霉菌株(PTR)。后续还将通过比较原始菌株与pTR菌株尼古丁降解能力的差异，验证该候选CYP的NND催化活性。
A.oryzae112822降解尼古丁的中间产物NMN是一类典型的六元杂环化合物，其吡啶环由N-甲基烟酰胺羟化酶催化发生α-羟基化并生成2HNMN。据报道以钼辅因子为催化中心的钼喋呤羟化酶(Xanthine dehydrogenase，XDH)不受芳杂环化合物侧链的影响，能够特异结合α位发生亲核取代反应，且A.oryzae RIB40注释基因组中仅存在一个预测xdh基因(GenBank:XM_001820144.3)，因此推测该基因编码的XDH(GenBank:XP_001820196.1)具有N-甲基烟酰胺羟化酶的催化功能。本论文通过硫酸铵分级沉淀对5mM NMN诱导培养条件下所得A.oryzae112822细胞裂解液进行40～70％硫酸铵沉淀蛋白粗分级获得粗酶液。在5mM NAD+和充足O2环境中，以2mM NMN(50mM KPB，pH6.5)为底物，28℃反应12h后，TLC和HPLC检测到脱盐浓缩后的粗酶液对NMN发生降解，且ESI-MS检测到该反应液存在m/z为174.99的分子离子峰([M+Na]+)，与2HNMN分子质量(152.06)一致，证明该粗酶液具有N-甲基烟酰胺羟化酶的催化活性;在1mM MTT和0.1mM PMS存在下，以3mM次黄嘌呤(50mM Tris-HCl,pH8.0)为底物，Native gradient PAGE胶在避光条件下的活性染色检测到XDH活性，显色条带的分子量大小为～270kDa;将该条带切胶后进行肽指纹图谱分析，结果显示与来源于A.oryzae RIB40的XDH肽段匹配率最高为62.41％，推测切胶纯化酶为XDH。根据A.oryzae RIB40基因组中预测的xdh基因序列设计引物并在起始密码子ATG前插入Kozak序列，以A.oryzae112822基因组为模板PCR扩增获得xdh基因片段，核苷酸序列比对结果与预测xdh基因一致。该基因大小为4080bp，编码1359个氨基酸，存在7个预测N-糖基化位点。将扩增所得xdh基因片段构建重组质粒pPICzα-xdh并在P.pastoris KM71中进行胞内可溶性表达，分离纯化所获纯酶SDS-PAGE后的Western-blotting检测到重组XDH的单亚基分子量为～175kDa，N-糖苷内切酶PNGaseF切割糖链后的SDS-PAGE检测到去糖基化重组酶的单亚基分子量为～150kDa，与理论分子量(148.3kDa)一致，证明该重组酶发生N-糖基化修饰;Native gradient PAGE检测到该重组酶天然聚合体的分子量为～342kDa，证明该酶活性状态下为二聚体形式蛋白。在5mM NAD+和充足O2环境中，以1mM NMN(50mM KPB，pH6.5)为底物，28℃反应48h后，TLC检测到重组XDH降解NMN并形成新的产物;ESI-MS检测到该反应液存在m/z为174.99的分子离子峰([M+Na]+)，与2HNMN分子质量(152.06)一致，因此将来源于A.oryzae112822的XDH鉴定为具有N-甲基烟酰胺羟化酶活性的XDH。本部分研究结合NMN底物降解活性与XDH活性的测定，开创性地完成了该途径中N-甲基烟酰胺羟化酶的基因鉴定和异源表达。
本论文围绕尼古丁降解菌株A.oryzae112822去甲基降烟碱途径，研究了该途径代谢相关细胞色素P450单加氧酶CYP620H1nt的NND催化活性和钼喋呤羟化酶XDH的N-甲基烟酰胺羟化酶活性，为阐释真菌尼古丁代谢途径关键酶及其基因的分子机理提供了重要的基础。