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丝状真菌里氏木霉具有极强的蛋白表达分泌能力，被认为是蛋白生产的良好宿主。但该菌表达异源蛋白时，产量往往不高，其中胞外蛋白酶造成目的蛋白降解是导致该问题的重要原因之一。因此，了解里氏木霉胞外蛋白酶分泌规律、构建胞外蛋白酶缺陷菌株是开发其成为优良蛋白表达分泌宿主的重要前提。胞外蛋白酶转录调控因子可全局调控其表达分泌，是实现控制蛋白酶产生的理想靶标。根据文献报道及实验室前期研究发现，类p53转录调控因子Vib1参与调控里氏木霉胞外蛋白酶及纤维素酶分泌，该转录调控因子缺失菌株具有较为纯净的胞外蛋白背景，有望将其开发为兼具蛋白产量高、分泌背景低的蛋白表达宿主。另外，异源蛋白分泌过程中，在内质网内折叠缓慢容易引起内质网压力响应并被导向胞内降解，从而造成分泌量不理想。研究发现，存在于酵母中的蛋白折叠监护元件Slp1-Emp65复合物(SE复合物)可保护折叠中的多肽免于错误降解。但该复合物在里氏木霉中的功能尚不明确，因此对里氏木霉SE复合物进行研究，有助于阐释其在丝状真菌蛋白合成中的作用机制，为构建高效蛋白表达分泌系统奠定基础。本论文的具体研究内容如下:
(1)探索了不同碳氮源条件下的里氏木霉胞外蛋白酶分泌规律。首先，通过脱脂奶粉平板和胞外蛋白酶活测定，分析了碳源(葡萄糖和乳糖)和氮源(硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨和玉米浆)对里氏木霉胞外蛋白酶分泌影响。结果发现，碳源可以影响胞外蛋白酶分泌，相较于葡萄糖，乳糖更有利于胞外蛋白酶的产生;尤其是氮源能够显著影响里氏木霉胞外蛋白酶产生，其中复杂氮源(如玉米浆等)能够大量诱导胞外蛋白酶，而优先利用氮源(如硫酸铵等)则对蛋白酶产生有阻遏作用。向里氏木霉发酵上清液中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)后，不同培养条件下(葡萄糖加蛋白胨、葡萄糖加玉米浆、乳糖加蛋白胨、乳糖加玉米浆)的胞外蛋白酶活力降低程度均在70％以上;而在添加金属蛋白酶抑制剂(EDTA)后，不同培养条件下的胞外蛋白酶活力降低程度约为20％，表明发酵上清中胞外蛋白酶活力主要由丝氨酸蛋白酶活力和金属蛋白酶活力组成。对不同碳源(葡萄糖和乳糖)和氮源(蛋白胨和玉米浆)培养条件下的胞外蛋白酶进行了质谱鉴定，共确定了29种胞外蛋白酶，包括13种丝氨酸蛋白酶、6种天冬氨酸蛋白酶以及10种金属蛋白酶;不同培养条件下的胞外蛋白酶组成存在差异。上述结果表明，里氏木霉胞外蛋白酶种类丰富且其分泌受碳氮源调控。
(2)构建了里氏木霉低蛋白酶背景分泌系统。本研究选取来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶(BGLA)作为模式蛋白，探究具有低蛋白酶背景的里氏木霉Δvib1菌株生产异源蛋白的可行性。在基因敲除菌株Δvib1及出发菌株QM53中，利用里氏木霉强组成型启动子Pcdna1成功驱动了bglA的表达。通过对BGLA表达菌株中相关基因的RT-qPCR分析发现，BGLA的表达并未诱导未折叠蛋白应答(UPR)、内质网相关蛋白降解(ERAD)途径的响应。综上所述，里氏木霉Δvib1菌株作为异源蛋白表达分泌系统具有低(蛋白酶)背景的优良性状。
(3)初步探究了里氏木霉潜在蛋白折叠监护元件SE复合物的功能。首先构建了slp1敲除菌株Δslp1、slp1过表达菌株OE-slp1、emp65敲除菌株Δemp65、emp65过表达菌株OE-emp65、slp1-emp6双敲除菌株ΔSE以及slp1-emp6同时过表达菌株OE-SE。分析了所构建菌株在不同浓度DTT处理条件下的生长速度，当使用10mMDTT处理时，Δemp65菌株的生长速度变慢，而ΔSE菌株无法在该条件下生长，表明上述菌株对于DTT的敏感度增强，推测SE复合物可能在内质网蛋白合成途径中发挥重要作用，且Emp65可能在这其中发挥更重要的作用。胞外蛋白酶活力测定显示，ΔSE菌株在发酵后期纤维素酶总酶活下降25％左右，外切葡聚糖酶活力下降约50％，其他菌株的纤维素分泌能力与出发菌株相比无明显变化，表明SE复合物可能在外切葡聚糖酶折叠加工过程中发挥作用。RT-qPCR分析发现，Δslp1及OE-slp1中的der1基因表达量上调，推测SE复合物可能与ERAD途径存在密切联系，而该联系可能是通过Slp1蛋白与Der1蛋白存在相互作用实现。为进一步确定SE复合物是否能够发挥蛋白折叠监护功能，在出发菌株QM53以及基因敲除菌株Δslp1中表达了内质网驻留蛋白GFPfast(ER-GFPfast)。荧光强度测定显示，Δslp1所表达的ER-GFPfast荧光强度低于QM53表达时的荧光强度，推测SE复合物可在内质网驻留蛋白GFPfast折叠过程中起到监护作用，避免其被错误降解。上述结果初步证明SE复合物参与里氏木霉的蛋白合成分泌，为进一步深刻理解该复合物在蛋白表达分泌途径中的作用机制奠定基础。
(1)探索了不同碳氮源条件下的里氏木霉胞外蛋白酶分泌规律。首先，通过脱脂奶粉平板和胞外蛋白酶活测定，分析了碳源(葡萄糖和乳糖)和氮源(硫酸铵、硝酸钠、蛋白胨和玉米浆)对里氏木霉胞外蛋白酶分泌影响。结果发现，碳源可以影响胞外蛋白酶分泌，相较于葡萄糖，乳糖更有利于胞外蛋白酶的产生;尤其是氮源能够显著影响里氏木霉胞外蛋白酶产生，其中复杂氮源(如玉米浆等)能够大量诱导胞外蛋白酶，而优先利用氮源(如硫酸铵等)则对蛋白酶产生有阻遏作用。向里氏木霉发酵上清液中添加丝氨酸蛋白酶抑制剂(PMSF)后，不同培养条件下(葡萄糖加蛋白胨、葡萄糖加玉米浆、乳糖加蛋白胨、乳糖加玉米浆)的胞外蛋白酶活力降低程度均在70％以上;而在添加金属蛋白酶抑制剂(EDTA)后，不同培养条件下的胞外蛋白酶活力降低程度约为20％，表明发酵上清中胞外蛋白酶活力主要由丝氨酸蛋白酶活力和金属蛋白酶活力组成。对不同碳源(葡萄糖和乳糖)和氮源(蛋白胨和玉米浆)培养条件下的胞外蛋白酶进行了质谱鉴定，共确定了29种胞外蛋白酶，包括13种丝氨酸蛋白酶、6种天冬氨酸蛋白酶以及10种金属蛋白酶;不同培养条件下的胞外蛋白酶组成存在差异。上述结果表明，里氏木霉胞外蛋白酶种类丰富且其分泌受碳氮源调控。
(2)构建了里氏木霉低蛋白酶背景分泌系统。本研究选取来源于黑曲霉的β-葡萄糖苷酶(BGLA)作为模式蛋白，探究具有低蛋白酶背景的里氏木霉Δvib1菌株生产异源蛋白的可行性。在基因敲除菌株Δvib1及出发菌株QM53中，利用里氏木霉强组成型启动子Pcdna1成功驱动了bglA的表达。通过对BGLA表达菌株中相关基因的RT-qPCR分析发现，BGLA的表达并未诱导未折叠蛋白应答(UPR)、内质网相关蛋白降解(ERAD)途径的响应。综上所述，里氏木霉Δvib1菌株作为异源蛋白表达分泌系统具有低(蛋白酶)背景的优良性状。
(3)初步探究了里氏木霉潜在蛋白折叠监护元件SE复合物的功能。首先构建了slp1敲除菌株Δslp1、slp1过表达菌株OE-slp1、emp65敲除菌株Δemp65、emp65过表达菌株OE-emp65、slp1-emp6双敲除菌株ΔSE以及slp1-emp6同时过表达菌株OE-SE。分析了所构建菌株在不同浓度DTT处理条件下的生长速度，当使用10mMDTT处理时，Δemp65菌株的生长速度变慢，而ΔSE菌株无法在该条件下生长，表明上述菌株对于DTT的敏感度增强，推测SE复合物可能在内质网蛋白合成途径中发挥重要作用，且Emp65可能在这其中发挥更重要的作用。胞外蛋白酶活力测定显示，ΔSE菌株在发酵后期纤维素酶总酶活下降25％左右，外切葡聚糖酶活力下降约50％，其他菌株的纤维素分泌能力与出发菌株相比无明显变化，表明SE复合物可能在外切葡聚糖酶折叠加工过程中发挥作用。RT-qPCR分析发现，Δslp1及OE-slp1中的der1基因表达量上调，推测SE复合物可能与ERAD途径存在密切联系，而该联系可能是通过Slp1蛋白与Der1蛋白存在相互作用实现。为进一步确定SE复合物是否能够发挥蛋白折叠监护功能，在出发菌株QM53以及基因敲除菌株Δslp1中表达了内质网驻留蛋白GFPfast(ER-GFPfast)。荧光强度测定显示，Δslp1所表达的ER-GFPfast荧光强度低于QM53表达时的荧光强度，推测SE复合物可在内质网驻留蛋白GFPfast折叠过程中起到监护作用，避免其被错误降解。上述结果初步证明SE复合物参与里氏木霉的蛋白合成分泌，为进一步深刻理解该复合物在蛋白表达分泌途径中的作用机制奠定基础。