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猪肉的生长速度和品质是猪遗传育种中重要的性状，这些性状主要取决于骨骼肌的生长发育过程。猪骨骼肌卫星细胞(porcine skeletal muscle satellite cells，PSCs)作为骨骼肌的干细胞，被激活后可以迅速增殖、分化、融合形成肌纤维，是研究骨骼肌生长发育的重要材料。长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类转录本长度大于200nt的RNA，可以在众多生物学过程中通过不同的调控机制发挥自己的功能，包括骨骼肌的生长发育过程。H19作为lncRNA中重要的一员，在猪骨骼肌生长发育及卫星细胞分化过程中的功能及调控机制还未有报道。因此，本研究使用猪骨骼肌卫星细胞作为研究材料，在细胞、分子水平探讨H19在猪骨骼肌卫星细胞分化过程的作用以及调控机制，初步构建了H19调控猪骨骼肌卫星细胞分化的分子模型，取得了以下结果：
1.成功分离猪骨骼肌卫星细胞，使用骨骼肌卫星细胞标记基因PAX7(Paired box 7)进行免疫荧光实验对其进行检测，同时在不同增殖分化时间点的卫星细胞中检测MYOG(myogenin)、MYOD(myogenic differentiation)、MYHC(myosin heavy chain)的表达水平，结果显示我们分离并差速贴壁纯化后的细胞纯度达到94%以上，且卫星细胞各时期基因表达水平与已有文献报道一致。
2.利用荧光定量PCR技术对H19在不同组织及卫星细胞不同增殖分化时间点的表达水平进行检测，结果表明H19在骨骼肌中高表达，且在卫星细胞分化过程中表达量持续上升；利用cDNA末端扩增技术(5′and 3′rapid amplification of cDNA ends，RACE)鉴定了H19的全长，利用核质分离和荧光原位杂交实验(Fluorescent in situ hybridization，FISH)鉴定了H19的亚细胞定位情况，结果显示，H19是一个长度为2280nt，具有poly(A)尾，同时在细胞核和细胞质内均有表达的lncRNA。
3.H19siRNA转染骨骼肌卫星细胞检测H19对其分化的影响，结果显示转染H19siRNA会显著抑制分化标记基因MYOG、MYOD、MYHC的表达，同时MYHC免疫荧光实验结果显示，H19siRNA会显著抑制肌管的形成，使肌管数目变少、肌管变细。
4.对敲低H19后诱导分化24h和36h的卫星细胞进行RNA-seq和miRNA-seq测序，对测序得到的差异基因进行功能富集，结果发现，多数的差异基因都富集到了跟肌肉相关的通路中。同时，本研究在RNA-seq数据及miRNA-seq数据中筛选到了既受H19调控，又与卫星细胞分化相关的基因和miRNA作为我们后续实验的研究对象。
5.通过RNA-seq数据和miRNA-seq数据，以及在线网站预测筛选得到miR-140-5p和其靶基因-SOX4(SRY-box transcription factor 4)。通过功能获得和缺失实验发现miR-140-5p具有抑制卫星细胞分化的功能，而SOX4具有促进卫星细胞分化的功能。双荧光素酶活性实验以及miR-140-5p的共沉淀(immunoprecipitation，IP)实验也证实了这三者之间存在直接的结合。本研究发现，H19与miR-140-5p、SOX4之间存在下述的分子调控模型，即H19可作为分子海绵，靶向miR-140-5p，与SOX4竞争性的结合miR-140-5p，解除miR-140-5p对SOX4的抑制作用，从而促进卫星细胞的分化。
6.通过pulldown实验发现了在细胞核内与H19结合的蛋白-TDP43(Transactive response DNA-binding protein 43)，通过RNA共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)以及共定位(Co-localization)实验验证了H19与TDP43的结合。TDP43的功能研究显示TDP43可以促进卫星细胞的分化，同时TDP43染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验以及MYOD启动子双荧光素酶活性实验结果显示TDP43在MYOD启动子有显著的富集，并且会促进MYOD启动子的活性。本研究发现，H19与TDP43直接结合，招募TDP43到MYOD的启动子上，促进MYOD启动子的活性，进而促进MYOD的转录，起到促进卫星细胞分化的作用。
7.Pulldown和RIP实验显示H19在细胞质内可以与DBN1(drebrin1)蛋白结合，功能研究结果显示DBN1也具有促进卫星细胞分化的作用。MYODChIP实验结果表明MYOD同时结合在H19和DBN1的启动子上，调控H19和DBN1的表达，H19和DBN1又结合在一起影响MYOD的表达。我们猜测这三者之间可能存在反馈调节环，协同促进卫星细胞的分化。
综上所述，本研究探究了H19促进猪骨骼肌卫星细胞分化中的功能，同时构建了H19调控猪骨骼肌卫星细胞分化的分子模型，为猪骨骼肌生长发育的研究提供了新的基因素材。
1.成功分离猪骨骼肌卫星细胞，使用骨骼肌卫星细胞标记基因PAX7(Paired box 7)进行免疫荧光实验对其进行检测，同时在不同增殖分化时间点的卫星细胞中检测MYOG(myogenin)、MYOD(myogenic differentiation)、MYHC(myosin heavy chain)的表达水平，结果显示我们分离并差速贴壁纯化后的细胞纯度达到94%以上，且卫星细胞各时期基因表达水平与已有文献报道一致。
2.利用荧光定量PCR技术对H19在不同组织及卫星细胞不同增殖分化时间点的表达水平进行检测，结果表明H19在骨骼肌中高表达，且在卫星细胞分化过程中表达量持续上升；利用cDNA末端扩增技术(5′and 3′rapid amplification of cDNA ends，RACE)鉴定了H19的全长，利用核质分离和荧光原位杂交实验(Fluorescent in situ hybridization，FISH)鉴定了H19的亚细胞定位情况，结果显示，H19是一个长度为2280nt，具有poly(A)尾，同时在细胞核和细胞质内均有表达的lncRNA。
3.H19siRNA转染骨骼肌卫星细胞检测H19对其分化的影响，结果显示转染H19siRNA会显著抑制分化标记基因MYOG、MYOD、MYHC的表达，同时MYHC免疫荧光实验结果显示，H19siRNA会显著抑制肌管的形成，使肌管数目变少、肌管变细。
4.对敲低H19后诱导分化24h和36h的卫星细胞进行RNA-seq和miRNA-seq测序，对测序得到的差异基因进行功能富集，结果发现，多数的差异基因都富集到了跟肌肉相关的通路中。同时，本研究在RNA-seq数据及miRNA-seq数据中筛选到了既受H19调控，又与卫星细胞分化相关的基因和miRNA作为我们后续实验的研究对象。
5.通过RNA-seq数据和miRNA-seq数据，以及在线网站预测筛选得到miR-140-5p和其靶基因-SOX4(SRY-box transcription factor 4)。通过功能获得和缺失实验发现miR-140-5p具有抑制卫星细胞分化的功能，而SOX4具有促进卫星细胞分化的功能。双荧光素酶活性实验以及miR-140-5p的共沉淀(immunoprecipitation，IP)实验也证实了这三者之间存在直接的结合。本研究发现，H19与miR-140-5p、SOX4之间存在下述的分子调控模型，即H19可作为分子海绵，靶向miR-140-5p，与SOX4竞争性的结合miR-140-5p，解除miR-140-5p对SOX4的抑制作用，从而促进卫星细胞的分化。
6.通过pulldown实验发现了在细胞核内与H19结合的蛋白-TDP43(Transactive response DNA-binding protein 43)，通过RNA共沉淀(RNA immunoprecipitation，RIP)以及共定位(Co-localization)实验验证了H19与TDP43的结合。TDP43的功能研究显示TDP43可以促进卫星细胞的分化，同时TDP43染色质免疫共沉淀(Chromatin immunoprecipitation，ChIP)实验以及MYOD启动子双荧光素酶活性实验结果显示TDP43在MYOD启动子有显著的富集，并且会促进MYOD启动子的活性。本研究发现，H19与TDP43直接结合，招募TDP43到MYOD的启动子上，促进MYOD启动子的活性，进而促进MYOD的转录，起到促进卫星细胞分化的作用。
7.Pulldown和RIP实验显示H19在细胞质内可以与DBN1(drebrin1)蛋白结合，功能研究结果显示DBN1也具有促进卫星细胞分化的作用。MYODChIP实验结果表明MYOD同时结合在H19和DBN1的启动子上，调控H19和DBN1的表达，H19和DBN1又结合在一起影响MYOD的表达。我们猜测这三者之间可能存在反馈调节环，协同促进卫星细胞的分化。
综上所述，本研究探究了H19促进猪骨骼肌卫星细胞分化中的功能，同时构建了H19调控猪骨骼肌卫星细胞分化的分子模型，为猪骨骼肌生长发育的研究提供了新的基因素材。