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葡萄座腔菌(Botryosphaeria dothidea)是引起轮纹病害的主要病原。我国梨树种植区均普遍感染轮纹病害，主要在梨枝干和果实上引起溃疡、轮纹症状，严重时造成毁园，影响了梨产业的健康发展。真菌病毒介导弱毒菌株可作为生物防治真菌病害的一条主要途径。本研究分析了侵染梨轮纹病菌菌株真菌病毒(BdCV1和BdPV1)对寄主表型、产孢、细胞结构等生物学特性的影响，对来源于湖北省梨寄主的轮纹病菌分离株(命名为LW-Hubei)进行了全基因组高通量测序和生物信息学分析，明确了梨轮纹病菌中存在RNAi组份成员，测定并分析了RNAi组份BdDicer2，对真菌病毒与梨轮纹病菌的影响，明确其基因功能。取得的结果为揭示梨轮纹病菌分子致病机理，以及梨-梨轮纹病菌-真菌病毒互作研究提供重要的分子信息和基因资源。
1.真菌病毒(BdCV1和BdPV1)与梨轮纹病菌互作的生物学特性研究
分析BdCV1和BdPV1与梨轮纹病菌互作的生物学特性表现，以及病毒表达量变化。LW-C(感染BdCV1病毒)和LW-1(复合感染BdCV1和BdPV1病毒)在PDA上形成黄色块状产孢体，LW-P(感染BdPV1病毒)和Mock(无病毒感染菌株)形成球状产孢体；4个菌株可萌发产生分生孢子角，其分生孢子形态存在一定差异。菌丝超微结构显示，LW-C和LW-1细胞变小、液泡空泡化严重、细胞壁增厚、细胞质液外渗、质壁分离、细胞核分散、线粒体肿胀；LW-P和Mock细胞核轮廓清晰、核仁颜色较深且面积较大、细胞壁厚度均匀，揭示了BdCV1对梨轮纹病菌生物学特性影响明显，进一步需从分子水平上探究真菌病毒对梨轮纹病菌的影响。
2.梨轮纹病菌全基因组序列测定及其功能分析
采用Denovo二代和三代测序结合生物信息学分析获得了高质量的梨轮纹病菌B.dothideaLW-Hubei分离株基因组全长为46.34Mb，49条scaffolds序列(12条2M以上，占全基因组86.4%)，重复序列占基因组9.3%，存在m4C和m6A甲基化，明确了B.dothideaLW-Hubei全基因组结构组份特点。基于core-pan和genefamily进化树分析，B.dothideaLW-Hubei与葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)成员Macrophominaphaseolina遗传进化关系最近。LW-Hubei全基因组共编码14,091个基因，13,135个基因进行功能注释，包括3,833个分泌蛋白，128个激酶，552个转运蛋白，351个CAZys，1,096个PHI等；明确了这些基因参与代谢途径、PHI途径、信号转导、应激反应等，证实了梨轮纹病菌中存在基因沉默(RNAi)组份。
3.梨轮纹病菌基因沉默(RNAi)组份分析及BdDicer2功能初步研究
分析了B.dothideaLW-Hubei中存在RNAi组份成员，包含2个BdDicers基因，3个BdRdRps和4个BdAgos。将本研究RNAi组份成员与报道的归属于真菌RNAi途径机制分离物一起基于氨基酸序列水平上进行进化树分析，结果显示，BdDicer2，BdRdRp3，BdAgo1，BdAgo3与报道属于Quelling途径中的分离物聚集为同一组群；BdDicer1，BdRdRp1，BdAgo2与报道属于MSUD途径中的分离物聚集为同一组群。BdRdRp2蛋白与未知功能途径NeurosporacrassaRdRp3聚集为同一组群，BdAgo4位于独立分支，无分离物同源蛋白聚类。RT-qPCR表达量分析显示，梨轮纹病菌RNAi组份在BdCV1和BdPV1感染菌株5d和10d菌丝中表达量整体呈上调表达趋势。
选取病毒感染上调表达的RNAi组份BdDicer2作为研究对象，经基因同源重组、单孢纯化以及RT-qPCR验证、分析，共获得2个敲除转化子LW-P/△BdDicer2。对比分析野生型LW-P和敲除转化子菌株△BdDicer2生物学特性差异，结果表明△BdDicer2菌株于PDA和CM上生长速率慢于野生型菌株LW-P，BdDicer2对KCl、Sorbitol和CaCl2条件下LW-P菌株生长均有一定影响；转化子△BdDicer2在梨果上的致病力弱于野生型菌株LW-P，其BdPV1病毒表达量低于LW-P。揭示了BdDicer2对病毒与梨轮纹病菌有一定的影响。
综合以上，本研究分析了真菌病毒与梨轮纹病菌互作的生物特性，首次测定并分析了梨轮纹病菌分离株LW-Hubei全基因组序列特点及其功能，为揭示梨轮纹病菌致病机理提供重要分子信息。验证并分析了RNAi组份BdDicer2对真菌病毒与寄主的影响，明确了BdDicer2参与了梨轮纹病菌与真菌病毒互作。取得的结果为探究参与真菌病毒互作的轮纹病菌基因功能分析提供了基因资源和材料，也为真菌病毒介导弱毒菌株用于防治梨轮纹病害提供了重要的分子信息和理论依据。
1.真菌病毒(BdCV1和BdPV1)与梨轮纹病菌互作的生物学特性研究
分析BdCV1和BdPV1与梨轮纹病菌互作的生物学特性表现，以及病毒表达量变化。LW-C(感染BdCV1病毒)和LW-1(复合感染BdCV1和BdPV1病毒)在PDA上形成黄色块状产孢体，LW-P(感染BdPV1病毒)和Mock(无病毒感染菌株)形成球状产孢体；4个菌株可萌发产生分生孢子角，其分生孢子形态存在一定差异。菌丝超微结构显示，LW-C和LW-1细胞变小、液泡空泡化严重、细胞壁增厚、细胞质液外渗、质壁分离、细胞核分散、线粒体肿胀；LW-P和Mock细胞核轮廓清晰、核仁颜色较深且面积较大、细胞壁厚度均匀，揭示了BdCV1对梨轮纹病菌生物学特性影响明显，进一步需从分子水平上探究真菌病毒对梨轮纹病菌的影响。
2.梨轮纹病菌全基因组序列测定及其功能分析
采用Denovo二代和三代测序结合生物信息学分析获得了高质量的梨轮纹病菌B.dothideaLW-Hubei分离株基因组全长为46.34Mb，49条scaffolds序列(12条2M以上，占全基因组86.4%)，重复序列占基因组9.3%，存在m4C和m6A甲基化，明确了B.dothideaLW-Hubei全基因组结构组份特点。基于core-pan和genefamily进化树分析，B.dothideaLW-Hubei与葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)成员Macrophominaphaseolina遗传进化关系最近。LW-Hubei全基因组共编码14,091个基因，13,135个基因进行功能注释，包括3,833个分泌蛋白，128个激酶，552个转运蛋白，351个CAZys，1,096个PHI等；明确了这些基因参与代谢途径、PHI途径、信号转导、应激反应等，证实了梨轮纹病菌中存在基因沉默(RNAi)组份。
3.梨轮纹病菌基因沉默(RNAi)组份分析及BdDicer2功能初步研究
分析了B.dothideaLW-Hubei中存在RNAi组份成员，包含2个BdDicers基因，3个BdRdRps和4个BdAgos。将本研究RNAi组份成员与报道的归属于真菌RNAi途径机制分离物一起基于氨基酸序列水平上进行进化树分析，结果显示，BdDicer2，BdRdRp3，BdAgo1，BdAgo3与报道属于Quelling途径中的分离物聚集为同一组群；BdDicer1，BdRdRp1，BdAgo2与报道属于MSUD途径中的分离物聚集为同一组群。BdRdRp2蛋白与未知功能途径NeurosporacrassaRdRp3聚集为同一组群，BdAgo4位于独立分支，无分离物同源蛋白聚类。RT-qPCR表达量分析显示，梨轮纹病菌RNAi组份在BdCV1和BdPV1感染菌株5d和10d菌丝中表达量整体呈上调表达趋势。
选取病毒感染上调表达的RNAi组份BdDicer2作为研究对象，经基因同源重组、单孢纯化以及RT-qPCR验证、分析，共获得2个敲除转化子LW-P/△BdDicer2。对比分析野生型LW-P和敲除转化子菌株△BdDicer2生物学特性差异，结果表明△BdDicer2菌株于PDA和CM上生长速率慢于野生型菌株LW-P，BdDicer2对KCl、Sorbitol和CaCl2条件下LW-P菌株生长均有一定影响；转化子△BdDicer2在梨果上的致病力弱于野生型菌株LW-P，其BdPV1病毒表达量低于LW-P。揭示了BdDicer2对病毒与梨轮纹病菌有一定的影响。
综合以上，本研究分析了真菌病毒与梨轮纹病菌互作的生物特性，首次测定并分析了梨轮纹病菌分离株LW-Hubei全基因组序列特点及其功能，为揭示梨轮纹病菌致病机理提供重要分子信息。验证并分析了RNAi组份BdDicer2对真菌病毒与寄主的影响，明确了BdDicer2参与了梨轮纹病菌与真菌病毒互作。取得的结果为探究参与真菌病毒互作的轮纹病菌基因功能分析提供了基因资源和材料，也为真菌病毒介导弱毒菌株用于防治梨轮纹病害提供了重要的分子信息和理论依据。