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鸡毒支原体(Mycoplasma gallisepticum, MG)主要引起鸡慢性呼吸道疾病(Chronic Respiratory Disease，CRD)，感染率极高，且常与其他病原微生物继发或并发感染，给世界家禽业带来巨大的经济损失。MG感染宿主后与特异受体结合，通过宿主呼吸黏膜屏障进入血液循环，导致全身器官和组织感染，但其致病机制至今尚未阐明。研究证实外泌体可携带miRNAs随循环系统进入邻近和远端的细胞或组织调控病原微生物感染。因此，探究外泌体中特异miRNAs对阐明MG的致病机理具有重要的价值。课题组前期高通量测序发现，MG-HS感染鸡原代肺泡Ⅱ型上皮细胞(CP-IIs)，培养液外泌体中gga-miR-193a极显著升高。本课题以外泌体中gga-miR-193a-3p为研究对象，选取CP-IIs为供体细胞，鸡胚成纤维细胞(DF-1)为受体细胞，探究其在MG感染中的作用及调控机制。主要结果如下：
1.通过超速离心和密度梯度离心法提取外泌体，纳米追踪分析仪检测其大小为30-150nm，透射电镜观察呈双层膜的圆形或椭圆形小囊泡，Westernblot显示含有标志蛋白CD63和CD9。qPCR检测表明，与未感染组相比，MG-HS感染组CP-IIs分泌的外泌体、CP-IIs和DF-1细胞内源gga-miR-193a-3p的相对表达量显著升高(p＜0.05)。
2.利用荧光标记技术，PKH67标记CP-IIs分泌的外泌体，Cy3标记gga-miR-193a-3p，与受体细胞DF-1共培养8h，共聚焦显微镜下发现外泌体可运载gga-miR-193a-3p进入DF-1细胞。qPCR检测显示，与摄取正常组外泌体相比，细胞摄取MG-HS感染组外泌体后gga-miR-193a-3p表达量极显著升高(p＜0.01)。CP-IIs超表达gga-miR-193a-3p，提取外泌体，利用10μL，100μL和500μL的外泌体分别与受体细胞孵育，24h收集细胞。与阴性对照相比，加入100μL和500μL外泌体，受体细胞中gga-miR-193a-3p的相对表达量显著升高(p＜0.01)。结果提示外泌体可携带gga-miR-193a-3p进入受体细胞，且随着添加量的增加而增加。
3.研究外泌体高表达的gga-miR-193a-3p对受体细胞增殖和凋亡的影响。一组DF-1细胞分别与MG-HS感染组外泌体(MG-Exo)和正常组外泌体(Nor-Exo)孵育，另一组分别转染gga-miR-193a-3pmimics和miR-NC。CCK-8检测显示，细胞处理24h，MG-Exo组细胞数量极显著低于Nor-Exo组(p＜0.01)，gga-miR-193a-3pmimics组和miR-NC组之间无显著差异；细胞处理36h后，MG-Exo组细胞数量极显著低于Nor-Exo组(p＜0.01)，gga-miR-193a-3pmimics组细胞数量显著低于miR-NC组(p＜0.05)，Nor-Exo组细胞数量极显著高于miR-NC组(p＜0.01)；细胞处理48h，流式细胞仪检测显示，MG-Exo组细胞凋亡率显著高于Nor-Exo组(p＜0.05)，gga-miR-193a-3pmimics组细胞凋亡率极显著高于miR-NC组(p＜0.01)，MG-Exo组细胞凋亡率极显著高于miR-NC组(p＜0.01)。说明外泌体高表达的gga-miR-193a-3p抑制受体细胞增殖，促进受体细胞凋亡。
4.探究外泌体高表达的gga-miR-193a-3p对受体细胞炎症反应的影响。组别与以上相同，在48h，ELISA检查显示，MG-Exo组细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著低于Nor-Exo组(p＜0.01)，gga-miR-193a-3pmimics组细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著低于miR-NC组和Nor-Exo组(p＜0.01)。证实外泌体高表达的gga-miR-193a-3p进入受体细胞后抑制其产生炎症反应。
5.通过在线软件miRDB、TargetScan和David等预测gga-miR-193a-3p的靶基因是KRAS；双荧光素酶报告系统检测证明，超表达gga-miR-193a-3p能极显著抑制(p＜0.01)KRAS3’UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性，抑制gga-miR-193a-3p能显著增强(p＜0.01)KRAS3’UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性，但对mut-P-KRAS3’UTR的荧光素酶活性无影响；DF-1细胞中转染gga-miR-193a-3pmimics能显著抑制(p＜0.01)KRAS基因mRNA和蛋白的表达量，而转染gga-miR-193a-3pinhibitor能显著上调(p＜0.01)KRAS基因mRNA和蛋白的表达量。证实KRAS是gga-miR-193a-3p的靶基因，且gga-miR-193a-3p负调控靶基因KRAS。
6.设置挽救试验进一步确证gga-miR-193a-3p的靶基因。一组DF-1分别转染KRAS的超表达载体pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)和pcDNA3.1，并感染MG-HS(KRAS-MG组和pcDNA3.1-MG组)，另一组细胞先转染pcDNA3.1-KRAS，并共转染gga-miR-193a-3pmimics(KRAS-miR-193a)，48h后检测KRAS的表达量。qPCR和Westernblot结果显示，超表达KRAS组KRAS的表达量极显著高于其他各组(p＜0.01)，pcDNA3.1-MG组KRAS的表达量极显著低于pcDNA3.1组(p＜0.01)。进一步确证了在MG-HS感染中KRAS是gga-miR-193a-3p的直接靶基因。
7.研究KRAS通过RAS/ERK信号通路参与MG-HS感染的调控。DF-1细胞中分别转染pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)、pcDNA3.1、si-KRAS和si-NC，转染48h，qPCR结果显示，KRAS组中RAF-MEK-ERK信号通路轴关键基因BRAF、MAP2K1和MAPK1表达量极显著高于pcDNA3.1组，干涉结果与此相反(p＜0.01)。Westernblot结果显示，KRAS组ERK的磷酸化蛋白(p-ERK)显著高于pcDNA3.1组，干涉结果与此相反(p＜0.01)。证明KRAS可能通过调控RAS/ERK信号通路发挥作用。
8.确证KRAS直接通过RAS/ERK信号通路发挥作用。一组DF-1细胞分别用U0126和DMSO处理，另一组DF-1细胞分别转染pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)和pcDNA3.1，并用U0126处理KRAS组(KRAS-U0126)，转染48h。qPCR结果显示，U0126组ERK的表达量极显著低于DMSO组(p＜0.01)，超表达KRAS组ERK的表达量极显著高于KRAS-U0126组和pcDNA3.1组(p＜0.01)。证实KRAS直接通过RAS/ERK信号通路在MG-HS感染中起作用。
9.研究gga-miR-193a-3p靶向KRAS对受体细胞增殖和凋亡的影响。DF-1细胞中分别转染重组质粒pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)、si-KRAS、U0126、pcDNA3.1、si-NC及DMSO，通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡。结果显示，在24h和36h，KRAS组细胞数量显著高于pcDNA3.1组(p＜0.05)；si-KRAS组和U0126组细胞数量极显著低于si-NC组和DMSO组(p＜0.01)；KRAS组细胞凋亡率显著高于pcDNA3.1组(p＜0.05)；si-KRAS组和U0126组细胞凋亡率极显著低于(p＜0.01)si-NC组和DMSO组。证实了外泌体高表达的gga-miR-193a-3p靶向KRAS抑制RAS/ERK信号通路抑制受体细胞增殖，促进受体细胞凋亡。
10.探究KRAS及信号通路RAS/ERK对受体细胞炎症反应的影响。DF-1细胞中分别转染重组质粒pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)、si-KRAS、U0126、pcDNA3.1、si-NC及DMSO。ELISA检测显示，KRAS组细胞中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著高于pcDNA3.1组(p＜0.01)；si-KRAS组和U0126组细胞中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著低于si-NC组和DMSO组(p＜0.01)。综合以上结果，本研究阐明感染细胞外泌体高表达的gga-miR-193a-3p靶向KRAS抑制RAS/ERK信号通路，抑制未感染细胞产生炎症反应调控MG-HS的感染。
1.通过超速离心和密度梯度离心法提取外泌体，纳米追踪分析仪检测其大小为30-150nm，透射电镜观察呈双层膜的圆形或椭圆形小囊泡，Westernblot显示含有标志蛋白CD63和CD9。qPCR检测表明，与未感染组相比，MG-HS感染组CP-IIs分泌的外泌体、CP-IIs和DF-1细胞内源gga-miR-193a-3p的相对表达量显著升高(p＜0.05)。
2.利用荧光标记技术，PKH67标记CP-IIs分泌的外泌体，Cy3标记gga-miR-193a-3p，与受体细胞DF-1共培养8h，共聚焦显微镜下发现外泌体可运载gga-miR-193a-3p进入DF-1细胞。qPCR检测显示，与摄取正常组外泌体相比，细胞摄取MG-HS感染组外泌体后gga-miR-193a-3p表达量极显著升高(p＜0.01)。CP-IIs超表达gga-miR-193a-3p，提取外泌体，利用10μL，100μL和500μL的外泌体分别与受体细胞孵育，24h收集细胞。与阴性对照相比，加入100μL和500μL外泌体，受体细胞中gga-miR-193a-3p的相对表达量显著升高(p＜0.01)。结果提示外泌体可携带gga-miR-193a-3p进入受体细胞，且随着添加量的增加而增加。
3.研究外泌体高表达的gga-miR-193a-3p对受体细胞增殖和凋亡的影响。一组DF-1细胞分别与MG-HS感染组外泌体(MG-Exo)和正常组外泌体(Nor-Exo)孵育，另一组分别转染gga-miR-193a-3pmimics和miR-NC。CCK-8检测显示，细胞处理24h，MG-Exo组细胞数量极显著低于Nor-Exo组(p＜0.01)，gga-miR-193a-3pmimics组和miR-NC组之间无显著差异；细胞处理36h后，MG-Exo组细胞数量极显著低于Nor-Exo组(p＜0.01)，gga-miR-193a-3pmimics组细胞数量显著低于miR-NC组(p＜0.05)，Nor-Exo组细胞数量极显著高于miR-NC组(p＜0.01)；细胞处理48h，流式细胞仪检测显示，MG-Exo组细胞凋亡率显著高于Nor-Exo组(p＜0.05)，gga-miR-193a-3pmimics组细胞凋亡率极显著高于miR-NC组(p＜0.01)，MG-Exo组细胞凋亡率极显著高于miR-NC组(p＜0.01)。说明外泌体高表达的gga-miR-193a-3p抑制受体细胞增殖，促进受体细胞凋亡。
4.探究外泌体高表达的gga-miR-193a-3p对受体细胞炎症反应的影响。组别与以上相同，在48h，ELISA检查显示，MG-Exo组细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著低于Nor-Exo组(p＜0.01)，gga-miR-193a-3pmimics组细胞中炎症因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著低于miR-NC组和Nor-Exo组(p＜0.01)。证实外泌体高表达的gga-miR-193a-3p进入受体细胞后抑制其产生炎症反应。
5.通过在线软件miRDB、TargetScan和David等预测gga-miR-193a-3p的靶基因是KRAS；双荧光素酶报告系统检测证明，超表达gga-miR-193a-3p能极显著抑制(p＜0.01)KRAS3’UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性，抑制gga-miR-193a-3p能显著增强(p＜0.01)KRAS3’UTR双荧光素酶报告基因的荧光素酶活性，但对mut-P-KRAS3’UTR的荧光素酶活性无影响；DF-1细胞中转染gga-miR-193a-3pmimics能显著抑制(p＜0.01)KRAS基因mRNA和蛋白的表达量，而转染gga-miR-193a-3pinhibitor能显著上调(p＜0.01)KRAS基因mRNA和蛋白的表达量。证实KRAS是gga-miR-193a-3p的靶基因，且gga-miR-193a-3p负调控靶基因KRAS。
6.设置挽救试验进一步确证gga-miR-193a-3p的靶基因。一组DF-1分别转染KRAS的超表达载体pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)和pcDNA3.1，并感染MG-HS(KRAS-MG组和pcDNA3.1-MG组)，另一组细胞先转染pcDNA3.1-KRAS，并共转染gga-miR-193a-3pmimics(KRAS-miR-193a)，48h后检测KRAS的表达量。qPCR和Westernblot结果显示，超表达KRAS组KRAS的表达量极显著高于其他各组(p＜0.01)，pcDNA3.1-MG组KRAS的表达量极显著低于pcDNA3.1组(p＜0.01)。进一步确证了在MG-HS感染中KRAS是gga-miR-193a-3p的直接靶基因。
7.研究KRAS通过RAS/ERK信号通路参与MG-HS感染的调控。DF-1细胞中分别转染pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)、pcDNA3.1、si-KRAS和si-NC，转染48h，qPCR结果显示，KRAS组中RAF-MEK-ERK信号通路轴关键基因BRAF、MAP2K1和MAPK1表达量极显著高于pcDNA3.1组，干涉结果与此相反(p＜0.01)。Westernblot结果显示，KRAS组ERK的磷酸化蛋白(p-ERK)显著高于pcDNA3.1组，干涉结果与此相反(p＜0.01)。证明KRAS可能通过调控RAS/ERK信号通路发挥作用。
8.确证KRAS直接通过RAS/ERK信号通路发挥作用。一组DF-1细胞分别用U0126和DMSO处理，另一组DF-1细胞分别转染pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)和pcDNA3.1，并用U0126处理KRAS组(KRAS-U0126)，转染48h。qPCR结果显示，U0126组ERK的表达量极显著低于DMSO组(p＜0.01)，超表达KRAS组ERK的表达量极显著高于KRAS-U0126组和pcDNA3.1组(p＜0.01)。证实KRAS直接通过RAS/ERK信号通路在MG-HS感染中起作用。
9.研究gga-miR-193a-3p靶向KRAS对受体细胞增殖和凋亡的影响。DF-1细胞中分别转染重组质粒pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)、si-KRAS、U0126、pcDNA3.1、si-NC及DMSO，通过CCK-8和流式细胞仪检测细胞增殖和凋亡。结果显示，在24h和36h，KRAS组细胞数量显著高于pcDNA3.1组(p＜0.05)；si-KRAS组和U0126组细胞数量极显著低于si-NC组和DMSO组(p＜0.01)；KRAS组细胞凋亡率显著高于pcDNA3.1组(p＜0.05)；si-KRAS组和U0126组细胞凋亡率极显著低于(p＜0.01)si-NC组和DMSO组。证实了外泌体高表达的gga-miR-193a-3p靶向KRAS抑制RAS/ERK信号通路抑制受体细胞增殖，促进受体细胞凋亡。
10.探究KRAS及信号通路RAS/ERK对受体细胞炎症反应的影响。DF-1细胞中分别转染重组质粒pcDNA3.1-KRAS(KRAS组)、si-KRAS、U0126、pcDNA3.1、si-NC及DMSO。ELISA检测显示，KRAS组细胞中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著高于pcDNA3.1组(p＜0.01)；si-KRAS组和U0126组细胞中促炎因子TNF-α和IL-1β的表达量极显著低于si-NC组和DMSO组(p＜0.01)。综合以上结果，本研究阐明感染细胞外泌体高表达的gga-miR-193a-3p靶向KRAS抑制RAS/ERK信号通路，抑制未感染细胞产生炎症反应调控MG-HS的感染。