论文部分内容阅读
中国水仙（Narcissus tazettavar.chinensis）是我国的十大传统名花之一，其叶形狭长优美，花淡雅清香，素有―凌波仙子‖的美称，颇具观赏价值。目前中国水仙的颜色单一，只有白色和黄色两种颜色，使得中国水仙的观赏价值和产业市场受到了很大的影响。开展中国水仙花色调控分子机制的研究对于中国水仙花色改良具有极大的意义。前期研究发现缺乏花青素是导致中国水仙花色单一的重要因素。花青素为类黄酮代谢的一个分支，为研究花青素与原花青素、黄酮醇三个分支间的调控机制，本研究以中国水仙?金盏银台‘为材料，使用染色体步移法克隆NtLAR基因启动子，研究中国水仙七个R2R3-MYB转录因子对类黄酮花青素、原花青素、黄酮醇三个分支关键基因NtFLS、NtDFR及NtLAR的调控机制，并在中国水仙上初步建立了以TRV病毒介导的VIGS体系，进一步验证R2R3-MYB的功能。主要研究成果如下：
1.以中国水仙?金盏银台‘DNA为模版，采用染色体步移法克隆了NtLAR基因起始密码子ATG上游启动子片段序列。测序结果显示克隆片段共995bp，GenBank登录号为MH371155。通过PlantCare数据库对获得的启动子序列顺式作用元件预测发现，NtLAR启动子序列中包含有大量顺式作用元件，如光反应元件ACE、G-box、GATA-motif、GT1-motif，激素响应元件CGTCA-motif、ABRE、TGACG-motif、TGA-element，胁迫响应元件和MYB结合位点MBS等。
2.将NtLAR启动子替换植物表达载体pBI121中的35S启动子，构建pBI121-pNtLAR::GUS载体研究启动子的功能。普通烟草瞬时表达显示，克隆的启动子具有启动子活性;pBI121-pNtLAR::GUS在水仙不同组织器官的瞬时表达实验发现，NtLAR基因的表达具有组织特异型，其在鳞茎盘的表达量较高，在花瓣和副冠中的表达量较低；将7个中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2，NtMYB3，NtMYB4，NtMYB5，NtMYB6，NtMYB7及NtMYB8分别与pBI121-pNtLAR::GUS载体共同注射普通烟草叶片，经GUS组织染色和qRT-PCR结果显示，NtMYB3,NtMYB4，NtMYB6和NtMYB8抑制NtLAR启动子的活性，而NtMYB2，NtMYB5和NtMYB7对NtLAR启动子的调控效果不明显。
3.采用双荧光素酶分析方法研究7个R2R3-MYB转录因子的功能。将类黄酮代谢途径花青素、原花青素、黄酮醇三个分支关键基因NtFLS、NtDFR、NtLAR的启动子分别插入pGreenII0800–LUC载体中构建pGreenII0800-pNtFLS-LUC、pGreenII0800-pNtDFR-LUC和pGreenII0800-pNtLAR-LUC载体，将7个R2R3-MYB表达载体分别与pGreenII0800-pNtFLS-LUC、pGreenII0800-pNtDFR-LUC和pGreenII0800-pNtLAR-LUC混合注射本式烟草叶片，分析结果显示，NtMYB2，NtMYB3和NtMYB5抑制NtFLS和NtDFR表达，NtMYB4激活NtFLS的表达，NtMYB6，NtMYB7和NtMYB8激活NtFLS和NtDFR表达；7个R2R3-MYB转录因子对于NtLAR的调控作用不显著。
4.初步建立了中国水仙VIGS技术体系。首先利用带有绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的TRV病毒载体注射中国水仙叶片，观察到TRV病毒在中国水仙植株体内可以移动，说明烟草TRV病毒可以用来建立水仙VIGS系统。克隆了中国水仙276bp的NtPDS基因片段，构建了VIGS载体pTRV2-NtPDS，比较注射器注射水仙叶片和浸泡水仙球两种方法对侵染效果的影响，结果两种方法侵染后叶片都出现褪绿现象，但浸泡法效果更好，定量PCR显示NtPDS基因的表达量显著下降。
5.应用VIGS技术进一步验证NtMYB3的功能。克隆298bp的NtMYB3基因片段，成功构建载体pTRV2-NtMYB3；将中国水仙鳞茎盘放入pTRV1和pTRV2-NtMYB3的混合侵染液中侵染后，DMACA染色显示，经pTRV1和pTRV2-NtMYB3侵染的鳞茎盘蓝色比对照明显变浅，说明鳞茎盘中原花青素含量下降，但同时，鳞茎盘中总黄酮含量明显上升，说明鳞茎盘中类黄酮代谢流向黄铜醇分支，总黄酮量升高，原花青素含量降低；定量PCR结果显示鳞茎盘中NtMYB3基因的表达量显著下降，说明通过VIGS抑制了鳞茎盘中NtMYB3的表达，定量PCR分析还表明鳞茎盘中NtFLS的表达量显著上升，NtDFR表达量并没有明显变化，验证了鳞茎盘中NtMYB3抑制了NtFLS的表达。
6.综合上述试验结果，初步提出了中国水仙花（花瓣和副冠）中和鳞茎盘中类黄酮代谢途径R2R3-MYB的调控模式：在花瓣和副冠中NtMYB2和NtMYB5抑制NtFLS和NtDFR表达，NtMYB4和NtMYB8激活NtFLS的表达；在鳞茎盘中NtMYB3是NtFLS和NtDFR的抑制因子，NtMYB6和NtMYB7激活NtFLS和NtDFR表达，而这3个R2R3-MYB转录因子对于NtLAR的调控作用并不显著。根据这个调控模式，结合前期各个基因的表达量，初步解释了中国水仙花中富含黄酮醇，鳞茎盘富含原花青素的现象。研究结果为了解中国水仙类黄酮代谢途径调控机制，通过分子育种手段创新中国水仙花色奠定基础。
1.以中国水仙?金盏银台‘DNA为模版，采用染色体步移法克隆了NtLAR基因起始密码子ATG上游启动子片段序列。测序结果显示克隆片段共995bp，GenBank登录号为MH371155。通过PlantCare数据库对获得的启动子序列顺式作用元件预测发现，NtLAR启动子序列中包含有大量顺式作用元件，如光反应元件ACE、G-box、GATA-motif、GT1-motif，激素响应元件CGTCA-motif、ABRE、TGACG-motif、TGA-element，胁迫响应元件和MYB结合位点MBS等。
2.将NtLAR启动子替换植物表达载体pBI121中的35S启动子，构建pBI121-pNtLAR::GUS载体研究启动子的功能。普通烟草瞬时表达显示，克隆的启动子具有启动子活性;pBI121-pNtLAR::GUS在水仙不同组织器官的瞬时表达实验发现，NtLAR基因的表达具有组织特异型，其在鳞茎盘的表达量较高，在花瓣和副冠中的表达量较低；将7个中国水仙R2R3-MYB转录因子NtMYB2，NtMYB3，NtMYB4，NtMYB5，NtMYB6，NtMYB7及NtMYB8分别与pBI121-pNtLAR::GUS载体共同注射普通烟草叶片，经GUS组织染色和qRT-PCR结果显示，NtMYB3,NtMYB4，NtMYB6和NtMYB8抑制NtLAR启动子的活性，而NtMYB2，NtMYB5和NtMYB7对NtLAR启动子的调控效果不明显。
3.采用双荧光素酶分析方法研究7个R2R3-MYB转录因子的功能。将类黄酮代谢途径花青素、原花青素、黄酮醇三个分支关键基因NtFLS、NtDFR、NtLAR的启动子分别插入pGreenII0800–LUC载体中构建pGreenII0800-pNtFLS-LUC、pGreenII0800-pNtDFR-LUC和pGreenII0800-pNtLAR-LUC载体，将7个R2R3-MYB表达载体分别与pGreenII0800-pNtFLS-LUC、pGreenII0800-pNtDFR-LUC和pGreenII0800-pNtLAR-LUC混合注射本式烟草叶片，分析结果显示，NtMYB2，NtMYB3和NtMYB5抑制NtFLS和NtDFR表达，NtMYB4激活NtFLS的表达，NtMYB6，NtMYB7和NtMYB8激活NtFLS和NtDFR表达；7个R2R3-MYB转录因子对于NtLAR的调控作用不显著。
4.初步建立了中国水仙VIGS技术体系。首先利用带有绿色荧光蛋白（Green fluorescent protein，GFP）的TRV病毒载体注射中国水仙叶片，观察到TRV病毒在中国水仙植株体内可以移动，说明烟草TRV病毒可以用来建立水仙VIGS系统。克隆了中国水仙276bp的NtPDS基因片段，构建了VIGS载体pTRV2-NtPDS，比较注射器注射水仙叶片和浸泡水仙球两种方法对侵染效果的影响，结果两种方法侵染后叶片都出现褪绿现象，但浸泡法效果更好，定量PCR显示NtPDS基因的表达量显著下降。
5.应用VIGS技术进一步验证NtMYB3的功能。克隆298bp的NtMYB3基因片段，成功构建载体pTRV2-NtMYB3；将中国水仙鳞茎盘放入pTRV1和pTRV2-NtMYB3的混合侵染液中侵染后，DMACA染色显示，经pTRV1和pTRV2-NtMYB3侵染的鳞茎盘蓝色比对照明显变浅，说明鳞茎盘中原花青素含量下降，但同时，鳞茎盘中总黄酮含量明显上升，说明鳞茎盘中类黄酮代谢流向黄铜醇分支，总黄酮量升高，原花青素含量降低；定量PCR结果显示鳞茎盘中NtMYB3基因的表达量显著下降，说明通过VIGS抑制了鳞茎盘中NtMYB3的表达，定量PCR分析还表明鳞茎盘中NtFLS的表达量显著上升，NtDFR表达量并没有明显变化，验证了鳞茎盘中NtMYB3抑制了NtFLS的表达。
6.综合上述试验结果，初步提出了中国水仙花（花瓣和副冠）中和鳞茎盘中类黄酮代谢途径R2R3-MYB的调控模式：在花瓣和副冠中NtMYB2和NtMYB5抑制NtFLS和NtDFR表达，NtMYB4和NtMYB8激活NtFLS的表达；在鳞茎盘中NtMYB3是NtFLS和NtDFR的抑制因子，NtMYB6和NtMYB7激活NtFLS和NtDFR表达，而这3个R2R3-MYB转录因子对于NtLAR的调控作用并不显著。根据这个调控模式，结合前期各个基因的表达量，初步解释了中国水仙花中富含黄酮醇，鳞茎盘富含原花青素的现象。研究结果为了解中国水仙类黄酮代谢途径调控机制，通过分子育种手段创新中国水仙花色奠定基础。