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我国是世界苹果第一生产大国，栽培面积和产量均占世界总量的一半以上。黄土高原地区是我国苹果的优生区和主产区，但由于该地区年降雨较少，蒸发量大，土壤盐渍化问题严重；此外，随着全球变暖，极端高温现象频繁出现，盐和高温胁迫是该区苹果产业面临的两个重要逆境问题。自噬是一个在真核生物中高度保守的细胞内大分子降解过程，其在植物细胞内的活性能够被多种非生物胁迫诱导。本课题组前期研究表明，自噬在苹果响应干旱及低氮中具有非常重要的作用。本研究则着力于挖掘自噬在苹果响应盐及高温胁迫中的功能，以3个苹果自噬基因MdATG8i、MdATG10和MdATG18a为对象，利用苹果转基因技术获得自噬活性增强的转基因苹果，并进一步通过生理和代谢分析，较系统地研究了自噬相关基因在苹果响应盐胁迫和高温胁迫时的功能及其可能的调控机制。主要研究结果如下：
1.盐胁迫下，过表达MdATG10的苹果植株根系中自噬活性增强，对盐胁迫的抗性提高。利用‘金冠’苹果cDNA为模板克隆得到自噬基因MdATG10，盐胁迫下，根系中MdATG10的转录水平受盐胁迫诱导上调表达幅度较叶片中高。在烟草中瞬时表达连接GUS载体的MdATG10启动子，盐处理后进行GUS染色，同样发现烟草根中GUS染色在盐处理后明显加深。利用转基因技术获得了3个过表达MdATG10的转基因苹果株系，对野生型及转基因植株同时进行120mMNaCl处理，发现盐处理下转基因植株的光合能力受损较小、生长受抑制程度较低、根系导水率较高。此外，盐胁迫下转基因植株体内Na+积累较少、Na+/K+比值较低，且转基因植株与野生型植株之间的差异在根系中表现最显著。对根系中离子转运相关基因的表达量进行检测，发现MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3、MdNHX1和MdAKT1的表达量均受盐胁迫的诱导上调，并且在转基因株系中的表达量高于野生型。自噬活性分析显示，转基因植株根系中自噬相关基因的表达量及自噬体数量高于野生型。以上结果表明，自噬可能通过影响盐胁迫下根系中的离子稳态提高苹果的耐盐性。
2.MdATG8i受盐胁迫诱导表达，在苹果中过表达该基因促进了盐胁迫下苹果叶片中精氨酸和多胺的积累，提高了苹果植株对低盐胁迫的抗性。前期对盐处理下苹果根系和叶片中MdATG8i的表达变化进行检测，发现其在叶片中的转录水平受盐胁迫诱导上调表达幅度更大。对野生型及MdATG8i过表达苹果植株进行75mMNaCl处理，发现在转基因植株中盐胁迫引起的生长抑制、活性氧和Na+的过量积累都得到了一定程度的缓解。盐胁迫下，转基因苹果植株中ABA含量增加和气孔开度缩小的幅度均低于野生型，使其在盐胁迫下能够维持较好的光合作用，缓解了盐胁迫引起的碳同化减少。此外，盐处理后转基因植株叶片中精氨酸和多胺含量均高于野生型，MdADC2的转录水平显著高于野生型，说明盐胁迫下转基因苹果植株中精氨酸的积累促进了其体内多胺含量的增加。自噬活性检测结果显示，过表达MdATG8i显著促进了盐胁迫下苹果叶片中自噬的发生，而自噬活性增强可能通过影响多胺代谢过程增强苹果的耐盐性。
3.MdATG18a通过降低苹果叶片叶绿体受到的伤害，提高转基因苹果对高温胁迫的抗性。不论是在番茄中异源表达，还是在苹果中过量表达，MdATG18a均能增强转基因植株对高温胁迫的抗性。高温处理下，过表达MdATG18a的苹果植株中自噬活性提高、抗氧化系统活性增强、有害活性氧积累减少、光合能力受影响较小。过表达苹果植株的CO2同化速率、光系统II的最大光化学效率Fv/Fm、光系统I和II的有效量子产量和电子传递效率均高于野生型。高温胁迫下转基因植株叶片气孔收缩程度较小，与野生型相比，高温下其散热能力更好。此外，高温胁迫引起叶绿体受损，而转基因植株叶片中异常或受损叶绿体的数量明显少于野生型，表明自噬活性增强能够促进植物细胞中受损叶绿体的降解，同时减少异常叶绿体产生的活性氧对细胞的损伤。与此同时，转基因植株中Hsp基因转录活性较高。这些结果从分子和生理的角度充分证明，苹果自噬活性的提高能够增强其抗氧化系统的活性和减少高温对光合系统的伤害，自噬在苹果的基础耐热性中起关键作用。
1.盐胁迫下，过表达MdATG10的苹果植株根系中自噬活性增强，对盐胁迫的抗性提高。利用‘金冠’苹果cDNA为模板克隆得到自噬基因MdATG10，盐胁迫下，根系中MdATG10的转录水平受盐胁迫诱导上调表达幅度较叶片中高。在烟草中瞬时表达连接GUS载体的MdATG10启动子，盐处理后进行GUS染色，同样发现烟草根中GUS染色在盐处理后明显加深。利用转基因技术获得了3个过表达MdATG10的转基因苹果株系，对野生型及转基因植株同时进行120mMNaCl处理，发现盐处理下转基因植株的光合能力受损较小、生长受抑制程度较低、根系导水率较高。此外，盐胁迫下转基因植株体内Na+积累较少、Na+/K+比值较低，且转基因植株与野生型植株之间的差异在根系中表现最显著。对根系中离子转运相关基因的表达量进行检测，发现MdSOS1、MdSOS2、MdSOS3、MdNHX1和MdAKT1的表达量均受盐胁迫的诱导上调，并且在转基因株系中的表达量高于野生型。自噬活性分析显示，转基因植株根系中自噬相关基因的表达量及自噬体数量高于野生型。以上结果表明，自噬可能通过影响盐胁迫下根系中的离子稳态提高苹果的耐盐性。
2.MdATG8i受盐胁迫诱导表达，在苹果中过表达该基因促进了盐胁迫下苹果叶片中精氨酸和多胺的积累，提高了苹果植株对低盐胁迫的抗性。前期对盐处理下苹果根系和叶片中MdATG8i的表达变化进行检测，发现其在叶片中的转录水平受盐胁迫诱导上调表达幅度更大。对野生型及MdATG8i过表达苹果植株进行75mMNaCl处理，发现在转基因植株中盐胁迫引起的生长抑制、活性氧和Na+的过量积累都得到了一定程度的缓解。盐胁迫下，转基因苹果植株中ABA含量增加和气孔开度缩小的幅度均低于野生型，使其在盐胁迫下能够维持较好的光合作用，缓解了盐胁迫引起的碳同化减少。此外，盐处理后转基因植株叶片中精氨酸和多胺含量均高于野生型，MdADC2的转录水平显著高于野生型，说明盐胁迫下转基因苹果植株中精氨酸的积累促进了其体内多胺含量的增加。自噬活性检测结果显示，过表达MdATG8i显著促进了盐胁迫下苹果叶片中自噬的发生，而自噬活性增强可能通过影响多胺代谢过程增强苹果的耐盐性。
3.MdATG18a通过降低苹果叶片叶绿体受到的伤害，提高转基因苹果对高温胁迫的抗性。不论是在番茄中异源表达，还是在苹果中过量表达，MdATG18a均能增强转基因植株对高温胁迫的抗性。高温处理下，过表达MdATG18a的苹果植株中自噬活性提高、抗氧化系统活性增强、有害活性氧积累减少、光合能力受影响较小。过表达苹果植株的CO2同化速率、光系统II的最大光化学效率Fv/Fm、光系统I和II的有效量子产量和电子传递效率均高于野生型。高温胁迫下转基因植株叶片气孔收缩程度较小，与野生型相比，高温下其散热能力更好。此外，高温胁迫引起叶绿体受损，而转基因植株叶片中异常或受损叶绿体的数量明显少于野生型，表明自噬活性增强能够促进植物细胞中受损叶绿体的降解，同时减少异常叶绿体产生的活性氧对细胞的损伤。与此同时，转基因植株中Hsp基因转录活性较高。这些结果从分子和生理的角度充分证明，苹果自噬活性的提高能够增强其抗氧化系统的活性和减少高温对光合系统的伤害，自噬在苹果的基础耐热性中起关键作用。