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文心兰(Oncidium hybridum)为兰科（Orchidaceae）文心兰属（Oncidium）植物，是重要的鲜切花品种，具有较高的观赏价值和经济价值。文心兰类原球茎（protocorm-like body，PLB）是兰花离体培养过程中相对于其他被子植物类群特有的发育现象，组织培养中通过类原球茎的诱导和增殖能够在短时间内获得大量兰花组培苗。兰科植物的合子胚（又称原球茎）和体细胞胚（又称为类原球茎）不具有根或根状结构，其根的出现要晚于茎端分生组织的分化。但是，已知的植物合子胚和体胚都依赖于根茎的两极分化而实现胚胎的形态建成，兰科植物的原球茎和类原球茎如何建立极性尚知之甚少。本研究对文心兰类原球茎分化的形态建成进行分析，从形态学和细胞学方面进行文心兰体胚发育过程研究，结合相关基因的表达，研究胚胎发生的极性在没有根的参与下如何建立，以及如何完成胚胎的分化和发育。主要结果如下：
1.文心兰类原球茎的形态建成研究
以文心兰类原球茎为材料，进行类原球茎的形态和细胞结构观察。类原球茎的发育过程与兰科植物种子胚发育过程相似。类原球茎培养30天左右根从基部的侧面产生。球形期类原球茎自愈伤组织中产生，球形期类原球茎纵向生长，上下两端逐步建立极性，基部有假根毛产生，随着类原球茎的伸长上部有叶原基形成，叶原基继续发育形成一个子叶，此时伸长类原球茎的基部的假根毛也在逐渐退化，这个过程中没有根的产生，直至形成具有茎叶结构的幼苗。细胞学观察结果表明：在球形期类原球茎向伸长类原球茎的发育过程中靠上部的顶端形成有纵向伸长的形成层，在较成熟的区域形成维管束，维管束与叶原基相连。文心兰类原球茎的形态建成是一种根不同步发生的非同步体细胞胚胎发生类型。
2.印度梨形孢与文心兰互作研究
印度梨形孢是根特异性内共生根菌。以生物标识的方法，通过以印度梨形孢与文心兰类原球茎的内共生与否，进行文心兰类原球茎是否存在潜在的根的分化的定性研究。本研究通过文心兰的类原球茎及组培苗与印度梨形孢共培养，研究根的分化与印度梨形孢侵染的相关性及印度梨形孢对根的识别。结果表明：印度梨形孢能够在文心兰的根中定殖，观察根的横切面发现印度梨形孢多定殖在表皮细胞中，皮层细胞中少量定殖，中柱中无定殖。纵切面中发现印度梨形孢主要在根部的伸长区定殖。在类原球茎发育过程中印度梨形孢均不能定殖，只有明确的根的结构时印度梨形孢才能够定殖，说明类原球茎发育成苗的过程中没有可以被印度梨形孢识别的根相关信号物质。根的分生组织形成远晚于茎分生组织的形成。
3.文心兰MYB1R1基因的克隆与表达分析
以文心兰的cDNA为模板，克隆得到文心兰MYB1R1基因的ORF序列，序列长954bp，预测可编码317个氨基酸。生物信息学表明该蛋白含有myb-SHAQKYF保守结构域，属于MYB转录因子家族的一员。不含信号肽，不属于分泌蛋白。
以文心兰组培苗的根、茎、叶为材料，利用qPCR技术研究文心兰MYB1R1基因在不同组织部位及印度梨形孢侵染后的根中的表达。结果显示，MYB1R1基因在根、茎、叶中均有表达，其中叶内的表达量最高。印度梨形孢与文心兰共培养20天后取根做MYB1R1的定量表达，发现印度梨形孢侵染后的组培苗根中MYB1R1的表达量都远高于原来根和茎中的表达量，说明与印度梨形孢共培养后组培苗的根更加具有被MYB1R1调控的能力，因此预测，由MYB1R1调控的包括抗性在内的下游基因的功能也会相应加强。印度梨形孢侵染后的组培苗根中MYB1R1的表达量更接近与未侵染的叶的表达量，说明印度梨形孢在根中的定殖加强了根中MYB1R1基因的表达，并可能促进MYB家族所调节的激素、抗性及光感应等功能。
4.电子传递蛋白FNR和Fd基因在文心兰类原球茎发育阶段和不同组织部位表达研究
FNR和Fd基因是植物能量代谢的末端电子传递蛋白和电子供体。文心兰FNR基因有叶型FNR（LFNR）和根型FNR（RFNR）两种。以文心兰类原球茎为材料，按不同发育阶段和组织区域进行取样：组培苗的根、茎、叶；球形期类原球茎；茎尖形成阶段的类原球茎（分化1）；茎尖形成并伸长阶段的类原球茎（分化2）。为研究茎尖和根的分化，在分化-1阶段中类原球茎上半部（分化1-上）和基部（分化1-下）及在分化-2阶段中类原球茎上半部（分化2-上）和基部（分化2-下）的组织也进行取样。qPCR结果表明：FNR和Fd在文心兰根、茎、叶、类原球茎、类原球茎分化的两个阶段及分化两个阶段的顶部和基部组织具有基因差异性表达，推测FNR和Fd基因在文心兰类原球茎的根茎极性建立中起重要作用。
5.凯氏带膜蛋白CASP基因在文心兰类原球茎发育阶段和不同组织部位表达研究
根据文心兰转录组数据筛选获得14条CASP基因的序列。生物信息学分析表明：CASP基因属于MAEVEL超家族，包含DUF588结构域。CASP蛋白序列的长度在179aa-331aa之间，有3个碱性蛋白，其余9个均为酸性蛋白；CASP蛋白中无规卷曲所占的比例最大。利用qPCR技术对文心兰CASP基因表达情况进行分析。结果表明：凯氏带膜蛋白CASP基因在文心兰根、茎、叶及类原球茎分化两个阶段和两个阶段的顶部和基部组织均有表达，且存在茎端和根端的极性表达，表明不同凯氏带基因成员参与文心兰根凯氏带的程度不同，其功能也必然存在区别。这种基因表达的差异可以作为根和茎叶分化的极性分化指标。
6.文心兰类原球茎离体形态建成中极性和组织分化的量化分析
为分析根的极性分化，本研究根据Fd、根型RFNR与叶型LFNR及CASP基因在根和茎端的差异性表达和在不同发育阶段的极值计算，根据在特定发育时期的基因定量PCR差异表达的结果，将各组织器官中各基因成员分为高表达和低表达两类，以同类基因成员的最高表达量的平均值作为特定组织器官在特定发育时期的极值。以试管苗根、茎叶的极值为对照对PLB各组织器官的极值作图，显示各组织器官的不同类别的基因在不同发育时期的极值位置，从而形象地显示出基因极性差异表达的量化图示，显示其组织和器官极性的程度。结果表明：从类原球茎整体发育方面分析，球形期的类原球茎接近根和茎的表达量中间，没有明显的极性。在类原球茎分化出茎尖时（分化-1），PLB向茎的方向分化，而根的方向减弱。在PLB分化出芽并伸长时（分化-2），根的分化加强，而茎的分化减弱。进一步研究发现，在PLB分化-1阶段，PLB上下两部分组织也都偏向茎的方向分化；而在分化-2阶段，PLB上部组织也保持向茎的方向分化，下部则向根的方向分化。从基因差异表达的分析结果看，PLB产生胚根的极性生长力脆弱。虽然在类原球茎形态建成过程中并没有根的产生，但是形态上有假根毛，结构上有维管束贯穿茎叶和基部，从基因表达谱上不出现根的形态建成的倾向性基因表达。因此，推测类原球茎的基部具有部分根的功能。类原球茎在生长发育过程中组织分化和形态建成伴随着基因的差异表达，显示出定量的极性和分化偏向性。
综上所述，本研究通过对文心兰类原球茎的形态建成和基因表达的研究，发现文心兰类原球茎直到形成幼苗后才有侧根的产生。根特异性共生菌印度梨形孢的接种共生实验表明，文心兰类原球茎中缺少可以被识别的根伸长区的因子。类原球茎的基部具有部分根的功能，类原球茎在生长发育过程中组织分化和形态建成伴随着基因的差异表达。在分子水平揭示了电子载体类看家基因和凯氏带相关的根的特异性基因都在类原球茎发育过程中处于茎叶的分化方向而不是根的分化方向。文心兰类原球茎的形态极性的分析，可以通过根特异性基因和看家基因的极性差异化表达进行定量，从而首次实现了形态发生和基因表达相关性的定量化描述，并提供了一种在细胞及分子水平定量化地和系统性地探讨生长发育机制的途径。
1.文心兰类原球茎的形态建成研究
以文心兰类原球茎为材料，进行类原球茎的形态和细胞结构观察。类原球茎的发育过程与兰科植物种子胚发育过程相似。类原球茎培养30天左右根从基部的侧面产生。球形期类原球茎自愈伤组织中产生，球形期类原球茎纵向生长，上下两端逐步建立极性，基部有假根毛产生，随着类原球茎的伸长上部有叶原基形成，叶原基继续发育形成一个子叶，此时伸长类原球茎的基部的假根毛也在逐渐退化，这个过程中没有根的产生，直至形成具有茎叶结构的幼苗。细胞学观察结果表明：在球形期类原球茎向伸长类原球茎的发育过程中靠上部的顶端形成有纵向伸长的形成层，在较成熟的区域形成维管束，维管束与叶原基相连。文心兰类原球茎的形态建成是一种根不同步发生的非同步体细胞胚胎发生类型。
2.印度梨形孢与文心兰互作研究
印度梨形孢是根特异性内共生根菌。以生物标识的方法，通过以印度梨形孢与文心兰类原球茎的内共生与否，进行文心兰类原球茎是否存在潜在的根的分化的定性研究。本研究通过文心兰的类原球茎及组培苗与印度梨形孢共培养，研究根的分化与印度梨形孢侵染的相关性及印度梨形孢对根的识别。结果表明：印度梨形孢能够在文心兰的根中定殖，观察根的横切面发现印度梨形孢多定殖在表皮细胞中，皮层细胞中少量定殖，中柱中无定殖。纵切面中发现印度梨形孢主要在根部的伸长区定殖。在类原球茎发育过程中印度梨形孢均不能定殖，只有明确的根的结构时印度梨形孢才能够定殖，说明类原球茎发育成苗的过程中没有可以被印度梨形孢识别的根相关信号物质。根的分生组织形成远晚于茎分生组织的形成。
3.文心兰MYB1R1基因的克隆与表达分析
以文心兰的cDNA为模板，克隆得到文心兰MYB1R1基因的ORF序列，序列长954bp，预测可编码317个氨基酸。生物信息学表明该蛋白含有myb-SHAQKYF保守结构域，属于MYB转录因子家族的一员。不含信号肽，不属于分泌蛋白。
以文心兰组培苗的根、茎、叶为材料，利用qPCR技术研究文心兰MYB1R1基因在不同组织部位及印度梨形孢侵染后的根中的表达。结果显示，MYB1R1基因在根、茎、叶中均有表达，其中叶内的表达量最高。印度梨形孢与文心兰共培养20天后取根做MYB1R1的定量表达，发现印度梨形孢侵染后的组培苗根中MYB1R1的表达量都远高于原来根和茎中的表达量，说明与印度梨形孢共培养后组培苗的根更加具有被MYB1R1调控的能力，因此预测，由MYB1R1调控的包括抗性在内的下游基因的功能也会相应加强。印度梨形孢侵染后的组培苗根中MYB1R1的表达量更接近与未侵染的叶的表达量，说明印度梨形孢在根中的定殖加强了根中MYB1R1基因的表达，并可能促进MYB家族所调节的激素、抗性及光感应等功能。
4.电子传递蛋白FNR和Fd基因在文心兰类原球茎发育阶段和不同组织部位表达研究
FNR和Fd基因是植物能量代谢的末端电子传递蛋白和电子供体。文心兰FNR基因有叶型FNR（LFNR）和根型FNR（RFNR）两种。以文心兰类原球茎为材料，按不同发育阶段和组织区域进行取样：组培苗的根、茎、叶；球形期类原球茎；茎尖形成阶段的类原球茎（分化1）；茎尖形成并伸长阶段的类原球茎（分化2）。为研究茎尖和根的分化，在分化-1阶段中类原球茎上半部（分化1-上）和基部（分化1-下）及在分化-2阶段中类原球茎上半部（分化2-上）和基部（分化2-下）的组织也进行取样。qPCR结果表明：FNR和Fd在文心兰根、茎、叶、类原球茎、类原球茎分化的两个阶段及分化两个阶段的顶部和基部组织具有基因差异性表达，推测FNR和Fd基因在文心兰类原球茎的根茎极性建立中起重要作用。
5.凯氏带膜蛋白CASP基因在文心兰类原球茎发育阶段和不同组织部位表达研究
根据文心兰转录组数据筛选获得14条CASP基因的序列。生物信息学分析表明：CASP基因属于MAEVEL超家族，包含DUF588结构域。CASP蛋白序列的长度在179aa-331aa之间，有3个碱性蛋白，其余9个均为酸性蛋白；CASP蛋白中无规卷曲所占的比例最大。利用qPCR技术对文心兰CASP基因表达情况进行分析。结果表明：凯氏带膜蛋白CASP基因在文心兰根、茎、叶及类原球茎分化两个阶段和两个阶段的顶部和基部组织均有表达，且存在茎端和根端的极性表达，表明不同凯氏带基因成员参与文心兰根凯氏带的程度不同，其功能也必然存在区别。这种基因表达的差异可以作为根和茎叶分化的极性分化指标。
6.文心兰类原球茎离体形态建成中极性和组织分化的量化分析
为分析根的极性分化，本研究根据Fd、根型RFNR与叶型LFNR及CASP基因在根和茎端的差异性表达和在不同发育阶段的极值计算，根据在特定发育时期的基因定量PCR差异表达的结果，将各组织器官中各基因成员分为高表达和低表达两类，以同类基因成员的最高表达量的平均值作为特定组织器官在特定发育时期的极值。以试管苗根、茎叶的极值为对照对PLB各组织器官的极值作图，显示各组织器官的不同类别的基因在不同发育时期的极值位置，从而形象地显示出基因极性差异表达的量化图示，显示其组织和器官极性的程度。结果表明：从类原球茎整体发育方面分析，球形期的类原球茎接近根和茎的表达量中间，没有明显的极性。在类原球茎分化出茎尖时（分化-1），PLB向茎的方向分化，而根的方向减弱。在PLB分化出芽并伸长时（分化-2），根的分化加强，而茎的分化减弱。进一步研究发现，在PLB分化-1阶段，PLB上下两部分组织也都偏向茎的方向分化；而在分化-2阶段，PLB上部组织也保持向茎的方向分化，下部则向根的方向分化。从基因差异表达的分析结果看，PLB产生胚根的极性生长力脆弱。虽然在类原球茎形态建成过程中并没有根的产生，但是形态上有假根毛，结构上有维管束贯穿茎叶和基部，从基因表达谱上不出现根的形态建成的倾向性基因表达。因此，推测类原球茎的基部具有部分根的功能。类原球茎在生长发育过程中组织分化和形态建成伴随着基因的差异表达，显示出定量的极性和分化偏向性。
综上所述，本研究通过对文心兰类原球茎的形态建成和基因表达的研究，发现文心兰类原球茎直到形成幼苗后才有侧根的产生。根特异性共生菌印度梨形孢的接种共生实验表明，文心兰类原球茎中缺少可以被识别的根伸长区的因子。类原球茎的基部具有部分根的功能，类原球茎在生长发育过程中组织分化和形态建成伴随着基因的差异表达。在分子水平揭示了电子载体类看家基因和凯氏带相关的根的特异性基因都在类原球茎发育过程中处于茎叶的分化方向而不是根的分化方向。文心兰类原球茎的形态极性的分析，可以通过根特异性基因和看家基因的极性差异化表达进行定量，从而首次实现了形态发生和基因表达相关性的定量化描述，并提供了一种在细胞及分子水平定量化地和系统性地探讨生长发育机制的途径。