东亚三角涡虫DjRlc基因的克隆、表达和功能研究

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涡虫是扁形动物门的代表动物,在生物的进化历程中占据着重要的地位,因为其强大的再生能力,已经成为研究发育、进化、再生与免疫的重要模式动物。肌球蛋白是一种多功能的球类蛋白,作为细胞骨架的重要组成成分,主要功能是为细胞的各种生理活动提供所需的力。肌球蛋白调节型轻链(regulativelightchainofmyosin)对肌球蛋白的活性具有调节作用。本文克隆了东亚三角涡虫(Dugesiajaponica)的肌球蛋白调节型轻链基因(DjRlc),并进行了涡虫的再生与免疫相关功能的研究。
  本研究利用RT-PCR和RACE技术克隆了DjRlc基因序列,DjRlc基因全长668bp,GenBank数据库序号为MG812315,5-非翻译区59bp,3-非翻译区81bp,最大开放阅读框为528bp,其编码了175个氨基酸,分子量约为20.21kDa。DjRlc蛋白含有肌球蛋白轻链的特征结构域。利用MAGE7.0构建进化树分析发现,东亚三角涡虫DjRlc位于的进化位置符合其进化地位。
  整体原位杂交技术分析发现,在成体或者再生涡虫中,DjRlc基因均表达于涡虫的肠;切片原位结果显示,进一步证明DjRlc基因主要表达于涡虫肠的实质组织;再生过程中的实时定量PCR结果显示,DjRlc基因的表达量在涡虫再生后期有明显增加。利用显微注射双链RNA的RNAi技术下调涡虫DjRlc基因表达,实时定量PCR检测结果显示,干扰DjRlc的涡虫中其基因表达量明显下降;整体原位杂交技术分析涡虫肠marker基因cuta在再生过程中的表达谱,结果表明,标记肠的阳性信号和对照组相比明显减少,肠的二级结构和三级结构分支数量减少,整个肠的再生过程延后。由此推断,DjRlc基因在涡虫肠的再生过程中发挥着重要的功能。
  实时定量PCR结果显示,经过LPS、PGN、β-葡聚糖和Poly(I∶C)诱导后,只有LPS诱导组DjRlc基因具有明显的差异性变化,由此推断,DjRlc基因可能特定的参与到涡虫的免疫过程。
  另外还构建了pET32a-DjRlc原核表达载体。DjRlc融合蛋白的成功表达,为以后在蛋白水平上更加深入的研究DjRlc的性质及其在涡虫再生、免疫过程中的功能做了铺垫。
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