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甲状腺激素受体(TR)属于核受体超家族的成员,广泛分布在各种组织中,常与类视黄醇X受体(RXR)组成TRs/RXR杂二聚体的形式,特异结合细胞核内靶基因序列中的甲状腺激素应答元件(TREs)。TR存在2种主要的亚型:TRα和TRβ。TRα和TRβ基因的转录本(transcript)因选择性剪接或转录起始位置的不同而产生若干同功体(isoform)。在已报告过的大鼠TRs:TRα1、TRα2、TRα3、TR△α1、TR△α2、TRβ1、TRβ2、TRβ3和TRΔβ3等9种亚型外,本室在研究甲状腺激素受体过程中又发现了一个新的同功体,被NCBI命名为TRβΔ,其mRNA仅较TRβ1的mRNA多出了一个108bp的片段,TRΔβ蛋白亦与TRβ1具有较高同源性,仅在近氨基端多出了36个氨基酸。TRβΔ蛋白是目前唯一的加长TRs亚型,具有非常重要的科学意义。
目的:为了检测新发现的一种甲状腺激素受体TRβΔ新亚型与RXRα、TREs(DR+4)结合的生物活性,设计了如下一些实验。
方法：
1.pETDuet-1/rRXRα重组表达载体的构建。自本室已经构建好的重组质粒pETDuet-1/rTRβΔ/rRXRα中获取rRXRα的cDNA,并将其插入原核表达载体pETDuet-1,DNA序列分析鉴定。
2.重组质粒在E.coli BL21(DE3)中的诱导表达:重组表达质粒pETDuet-1/rRXRα转化入E.coli BL21(DE3),37℃,IPTG(1mmol/L)诱导表达6小时,SDS-PAGE鉴定表达产物大小和表达量,Western-blot进一步鉴定。重组表达质粒pETDuet-1/rTRβ1与pETDuet-1/rTRβΔ的IPTG诱导表达,并对二者的诱导表达产物进行SDS-PAGE、Western Blot鉴定。
3.免疫共沉淀(Co-IP)鉴定TRβ1/RXRα、TRβΔ/RXRα杂二聚体的形成。分别建立TRβ1-RXRα,TRβΔ-RXRα两种重组蛋白的复合物,分别以兔抗RXRα抗体或小鼠抗His抗体进行免疫共沉淀实验,沉淀物以小鼠抗His抗体或兔抗RXRα抗体进行Western Blot检测。
4.TRβΔ与DNA结合活性鉴定。先将TRβ1、TRβΔ蛋白分别与RXRα蛋白室温下共同孵育,然后运用电泳迁移率改变试验(EMSA)检测杂二聚体的DNA结合能力,同时检测单独的TRβΔ、TRβ1、RXRα蛋白分别与TREs(DR+4)的结合情况。
结果：
1.成功构建了pETDuet-1/rRXRα重组表达载体。
2.成功表达了RXRα融合蛋白:重组质粒pETDuet-1/rRXRα转化菌、pETDuet-1/TRβ1转化菌和pETDuet-1/TRβΔ转化菌诱导表达产物的SDS-PAGE均在约55kD附近出现深染条带(RXRα约50kD,TRβ1约52kD,TRβΔ约56kD),目的蛋白大小与预期基本一致,且主要存在于包涵体中。RXRα、TRβ1、TRβΔ的表达量分别达到213.8mg/L、251.0mg/L、161.9mg/L培养基,三种重组蛋白占菌体总蛋白的百分比分别为32.2％、30.5％、28.8％。
3.包涵体形式的RXRα、TRβ1、TRβΔ重组蛋白可溶解于高浓度的尿素溶液中,经透析后占上清液的主要部分。
4.免疫共沉淀证实TRβΔ及TRβ1均能够与RXRα蛋白分别形成TRβΔ/RXRα、TRβ1/RXRα杂二聚体。
5.TRβ1、TRβΔ两种蛋白与RXRα形成杂二聚体后均能够结合TREs(DR+4),而且单独的RXRα、TRβ1、TRβΔ蛋白也分别能够结合TREs(DR+4)。
结论：本文通过构建pETDuet-1/rRXRα重组表达载体成功表达了RXRα蛋白。结果证实甲状腺激素受体TRβΔ同TRβ1一样,能与RXRα形成杂二聚体结合DNA,而且TRβΔ、TRβ1和RXRα三者均具有DNA结合活性。研究结果与Williams报道有所不同,据Williams其文中报道单独的TRβ1、RXRα蛋白均不能够结合TREs(DR+4),只有在TRβ1和RXRα共同孵育形成TRβ1/RXRα杂二聚体之后才能与TREs(DR+4)结合。而本文显示TRβΔ、TRβ1甚至RXRα本身单独也能结合DR+4,但它们是以单体抑或是同二聚体与DNA结合有待于进一步研究。