金乌健骨方对类风湿关节炎滑膜细胞自噬调控作用研究

• 作 者: 曾晨
• 机 构: 贵阳中医学院
• 出 处: 贵阳中医学院
• 发表日期: 2018年期
• 关键词: 类风湿关节炎

目的：1.通过建立人类风湿关节炎成纤维样滑膜细胞(RA-FLS)模型，观察金乌健骨方总提物对RA-FLS增殖的影响;
　　2.通过观察金乌健骨方总提物诱导RA-FLS自噬的产生，并通过其对相关自噬基因LC3、Beclin-1、Bcl-2、VPS34及LC3、Beclin-1蛋白表达水平的影响，探讨金乌健骨方总提物对RA-FLS自噬调控作用。
　　方法：利用醇提法制备金乌健骨方总提物，收集新鲜提取的RA滑膜组织并进行培养，选用3-5代RA-FLS为研究对象，分别加入无血清培养基、雷公藤多苷、不同浓度的金乌健骨方总提物干预24h;利用MTT法检测浓度不同的金乌健骨方总提物对RA-FLS增殖的抑制作用;通过透射电镜观察各刺激组诱导RA-FLS的自噬情况;采用聚合酶链式反应(PCR)检测各组细胞LC3、Bclin-1、Bcl-2、VPS34的基因表达情况;采用蛋白印迹法(western blot)检测各组细胞总蛋白中LC3、Beclin-1的蛋白活性情况。
　　结果：1.MTT检测结果空白对照组的RA-FLS呈现持续增殖的状态，经过不同浓度的金乌健骨方总提物干预24h后，与空白对照组相比，随着药物浓度的增加，RA-FLS OD值逐渐降低，细胞生长抑制率逐渐升高。
　　2.透射电镜观察细胞自噬情况空白对照组无明显自噬小体或自噬溶酶体，各给药组RA-FLS胞浆中的自噬小体和自噬溶酶体均有不同程度增多。
　　3.PCR检测结果与空白对照组相比，各给药组RA-FLS中LC-3、Beclin-1、VPS34mRNA的表达量均有所下降，而Bcl-2mRNA的表达量升高，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。与雷公藤多苷组相比，金乌健骨方总提物中、低剂量组下调LC-3、Beclin-1、VPS34mRNA的作用无明显差异(P＞0.05)，而金乌健骨方总提物高剂量组LC-3、Beclin-1、VPS34mRNA表达水平更低，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)，与雷公藤多苷组相比，金乌健骨方总提物高剂量组Bcl-2表达水平更高，差异具有显著统计学意义(P＜0.01)。
　　4.WB检测结果与空白对照组比较，不同药物组细胞总蛋白中LC3、Beclin-1的蛋白表达水平明显下降(P＜0.01)。金乌健骨方总提物低、中剂量组LC3、Beclin-1的蛋白表达水平，与雷公藤多苷对照组比较具有明显差异(P＜0.05)，而高剂量组下调LC3、Beclin-1蛋白表达的作用与雷公藤多苷对照组比较无明显差异(P＞0.05)。
　　结论：1.金乌健骨方总提物具有抑制RA-FLS增殖的作用。
　　2.金乌健骨方总提物能够诱导RA-FLS胞浆中的自噬小体以及溶酶体的生成。
　　3.金乌健骨方总提物能够抑制RA-FLS中LC3、Beclin-1和VPS34基因的表达水平，增强Bcl-2基因在RA-FLS中的表达。
　　4.金乌健骨方总提物能够抑制自噬相关基因LC3、Beclin-1的蛋白活性。