重组天花粉蛋白--抗原肽疫苗的构建及其肿瘤治疗的研究

• 作 者: 吴爱花
• 机 构: 广州中医药大学
• 出 处: 广州中医药大学
• 发表日期: 2018年01期
• 关键词: 重组天花粉蛋白

目的:
　　构建一个“allinone”(一体化)的肿瘤疫苗递药系统(穿膜肽-天花粉蛋白-抗原肽)，用于肿瘤的透皮免疫治疗。通过基因重组技术将肿瘤抗原肽序列和穿膜肽序列融合在天花粉蛋白基因序列的两端，通过原核表达系统制备重组多功能蛋白疫苗。对该体系进行表征，并在体内外评价该肿瘤疫苗的作用。
　　方法:
　　1.以天花粉蛋白(Trichosanthin，TCS)为研究对象，利用基因工程技术将抗原肽(legumain，氨基酸序列EDVTPENFLAVLR;Trp2，氨基酸序列SVYDFFVWL)融合在TCS融合基因的C端，得到重组天花粉蛋白-抗原肽重组蛋白;并将穿膜肽(LMWP，氨基酸序列RRRRRRGGRRRR)融合到TCS融合基因的N端，构建得到穿膜肽-天花粉蛋白-抗原肽重组蛋白。将该融合基因克隆到原核表达载体pMXB10上，进行重组质粒rTCS-leg-intein-CBD、rTCS-Trp2-intein-CBD、rLTL-intein-CBD和rLTT-intein-CBD融合蛋白的表达。用几丁质柱亲和纯化，并用半胱氨酸在柱上进行切割，一步纯化得到重组蛋白。
　　2.研究了两种重组疫苗在体外活化刺激免疫细胞的作用。采用流式细胞仪和倒置荧光显微镜考察该体系在树突状细胞的摄取，MTT法考察其对树突状细胞的毒性效果。考察该体系对促进树突状细胞成熟的作用，及促进T细胞的增殖作用。
　　3.本研究考察了重组天花粉蛋白-抗原肽疫苗对鼠结肠癌皮下移植瘤动物肿瘤模型以及鼠黑色素瘤皮下移植瘤动物模型的药效学实验以及对生物安全性的评估。另外，考察了使用重组蛋白疫苗后，该体系是否可以促进体内CD4+T细胞和CDS+T细胞的增殖。初步评价了该体系的抗肿瘤的机制。
　　成果:
　　本研究成功制备了rTCS、rTCS-leg、rLTL、rTCS-Trp2、rLTT五种重组蛋白。体外活性实验研究结果显示，重组穿膜肽-天花粉蛋白-抗原肽疫苗可明显增强其细胞摄取率，并能有效地活化树突状细胞并促进T细胞的增殖。体内实验结果表明，重组穿膜肽-天花粉蛋白-抗原肽疫苗可以有效促进CD4+T细胞和CDS+T细胞的增殖及Th1型细胞因子IFN-γ、IL-2等的分泌及抑制TGF-β、IL-10等抑炎因子的分泌，显著增强T细胞的抗肿瘤作用，从而有效地抑制肿瘤的生长，提高荷瘤小鼠的生存率。
　　结论:
　　天花粉蛋白具有较好的免疫促进作用，穿膜肽的修饰可显著提高重组天花粉蛋白的免疫治疗作用，本研究提供了一个基于天花粉蛋白的肿瘤重组疫苗构建方法及新的免疫治疗思路。