论文部分内容阅读
以石油基副产物十三烷(C13)为底物，利用微生物转化可以合成用途广泛的十三碳二元酸(DCA13)精细化学品。C13的吸收过程是实现DCA13生物合成的关键环节，但目前研究主要集中在催化氧化过程，对于C13吸收及其后续界面催化关注较少。因此从C13的吸收利用角度研究DCA13生物合成有助于进一步提高其转化效率。微生物对C13的吸收过程中表面活性剂发挥着至关重要的作用。生物表面活性剂不仅具有优良的表界面活性和乳化特性，还具有结构的可塑性及生物可降解性，比现有化学表面活性剂(如吐温)具有显著应用优势，同时当生物表面活性剂与相应底物结构类似时，其乳化效果更好。目前尚未见生物表面活性剂应用于DCA13生物转化合成体系中的研究报道。因此，本文拟以C13为底物，筛选能够合成特定结构生物表面活性剂的微生物；对相应表面活性剂的结构组成与理化特性进行研究；并将所获得的生物表面活性剂应用于维斯假丝酵母(Candida viswanathii ， C. viswanathii)生物转化C13生产DCA13的体系中。为解决DCA13生物转化生产中底物C13的吸收利用难题提供新思路，同时也为其他烷烃精细化学品的生物制造和新工艺提供理论指导。本文取得的研究成果如下：
(1)筛选得到一株可以高效乳化C13的生物表面活性剂产生菌。从长期受石油污染的环境中取样，对土样中的微生物不断施加C13选择压力，以发酵液中菌株的生长状况和C13乳化率为指标，筛选出以C13为唯一碳源进行生长并产生表面活性剂的菌株3株，其中实验室编号为HG50的菌株，在发酵培养基中生长状况较好且C13乳化率较高。结合形态学观察、主要生理生化指标和16SrDNA分子鉴定，确定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa)。
(2)鉴定菌株HG50所产表面活性剂为鼠李糖脂，其组成中包含有与C13结构类似的鼠李糖脂同系物，具有比吐温60和常规鼠李糖脂更好的理化特性。采用酸沉淀法，从菌株HG50的发酵液中分离获得生物表面活性剂粗品，产量1.76g/L发酵液，对比当前已报道的野生P.aeruginosa的生物表面活性剂产量(普遍1-2g/L发酵液)，表明筛选到的该菌株具有良好的生物表面活性剂产生能力。结合薄层色谱(TLC)和傅里叶红外光谱(FTIR)对所获粗品进行成分分析，初步确认该生物表面活性剂为鼠李糖脂。利用苯酚硫酸法测定该粗品中总鼠李糖脂含量为68.3%。进一步通过溶剂萃取和硅胶柱层析法对粗品进行纯化，制得HG50鼠李糖脂产品。以鼠李糖脂标准品中Rha-Rha-C10-C10和Rha-C10-C10两种成分为参照，利用UPLC-MS对产品的具体组成和结构进行解析，发现该生物表面活性剂由系列鼠李糖脂同系物组成，其中含量最多的同系物形式为Rha-Rha-C10-C10，占比12.7%。此外还包含鼠李糖与C13和C12脂的杂合体(Rha-Rha-C13-C12/Rha-Rha-C12-C13)，即新型鼠李糖脂，占比2.17%，证实含有特定结构的鼠李糖脂被成功合成。通过实验绘制表面张力曲线，测定吐温60、鼠李糖脂标准品(RL)和HG50鼠李糖脂(HG50 RL)的临界胶束浓度分别为30mg/L、150mg/L和200mg/L，在临界胶束浓度下的排油圈直径分别为2.1cm、5.2cm和5.4cm，对石蜡的乳化指数分别为53%、60%和64%，对C13的乳化指数分别为40%、63%和65%。上述指标说明HG50所产鼠李糖脂具有比吐温60和普通鼠李糖脂更强的表界面和乳化活性。此外，比较上述三种表面活性剂的环境耐受性，发现HG50RL的稳定性要优于吐温60和RL，在温度-20℃-100℃，pH值2-12，盐浓度0-10g/L的范围内均能保持较高的表面活性。
(3)研究了HG50鼠李糖脂在C.viswanathii生物转化C13生产DCA13中的应用，发现由HG50RL/ExxalC13/C13/C.viswanathii粗酶液构建的四元逆胶束体系具有较好的催化转化C13生成DCA13的效果。选择C.viswanathii进行DCA13生物合成，对该菌转化C13合成目标产物进行动态分析，发现DCA13的积累主要集中在转化第1-3d，其中第2d时DCA13产量达到最高，此后DCA13含量下降至低于检测限，而相应C11、C9、C7以及C5二元酸含量逐渐升高。不同表面活性剂吐温60、RL和HG50RL分别单独添加到C13转化培养基时对C13乳化率作用依次增强；但在接种C.viswanathii后，RL和HG50RL两组的C13乳化率均低于吐温60组，表明鼠李糖脂类对DCA13产生菌及其吸收过程有较强的抑制作用。为此，选用异构十三醇(Exxal C13)作为助表面活性剂，发酵2d的C.viswanathii粗酶液为水相来源，构建了上述不同表面活性剂/ExxalC13/C13/粗酶液四元逆胶束酶催化体系，结果显示由HG50RL参与构成的逆胶束酶催化体系DCA13产量较高，比相同条件下使用传统吐温60工艺提高了12%。
以上研究初步实现了生物表面活性剂在DCA13生物转化生产体系中的新应用。
(1)筛选得到一株可以高效乳化C13的生物表面活性剂产生菌。从长期受石油污染的环境中取样，对土样中的微生物不断施加C13选择压力，以发酵液中菌株的生长状况和C13乳化率为指标，筛选出以C13为唯一碳源进行生长并产生表面活性剂的菌株3株，其中实验室编号为HG50的菌株，在发酵培养基中生长状况较好且C13乳化率较高。结合形态学观察、主要生理生化指标和16SrDNA分子鉴定，确定该菌株为铜绿假单胞菌(Pseudomonas aeruginosa，P. aeruginosa)。
(2)鉴定菌株HG50所产表面活性剂为鼠李糖脂，其组成中包含有与C13结构类似的鼠李糖脂同系物，具有比吐温60和常规鼠李糖脂更好的理化特性。采用酸沉淀法，从菌株HG50的发酵液中分离获得生物表面活性剂粗品，产量1.76g/L发酵液，对比当前已报道的野生P.aeruginosa的生物表面活性剂产量(普遍1-2g/L发酵液)，表明筛选到的该菌株具有良好的生物表面活性剂产生能力。结合薄层色谱(TLC)和傅里叶红外光谱(FTIR)对所获粗品进行成分分析，初步确认该生物表面活性剂为鼠李糖脂。利用苯酚硫酸法测定该粗品中总鼠李糖脂含量为68.3%。进一步通过溶剂萃取和硅胶柱层析法对粗品进行纯化，制得HG50鼠李糖脂产品。以鼠李糖脂标准品中Rha-Rha-C10-C10和Rha-C10-C10两种成分为参照，利用UPLC-MS对产品的具体组成和结构进行解析，发现该生物表面活性剂由系列鼠李糖脂同系物组成，其中含量最多的同系物形式为Rha-Rha-C10-C10，占比12.7%。此外还包含鼠李糖与C13和C12脂的杂合体(Rha-Rha-C13-C12/Rha-Rha-C12-C13)，即新型鼠李糖脂，占比2.17%，证实含有特定结构的鼠李糖脂被成功合成。通过实验绘制表面张力曲线，测定吐温60、鼠李糖脂标准品(RL)和HG50鼠李糖脂(HG50 RL)的临界胶束浓度分别为30mg/L、150mg/L和200mg/L，在临界胶束浓度下的排油圈直径分别为2.1cm、5.2cm和5.4cm，对石蜡的乳化指数分别为53%、60%和64%，对C13的乳化指数分别为40%、63%和65%。上述指标说明HG50所产鼠李糖脂具有比吐温60和普通鼠李糖脂更强的表界面和乳化活性。此外，比较上述三种表面活性剂的环境耐受性，发现HG50RL的稳定性要优于吐温60和RL，在温度-20℃-100℃，pH值2-12，盐浓度0-10g/L的范围内均能保持较高的表面活性。
(3)研究了HG50鼠李糖脂在C.viswanathii生物转化C13生产DCA13中的应用，发现由HG50RL/ExxalC13/C13/C.viswanathii粗酶液构建的四元逆胶束体系具有较好的催化转化C13生成DCA13的效果。选择C.viswanathii进行DCA13生物合成，对该菌转化C13合成目标产物进行动态分析，发现DCA13的积累主要集中在转化第1-3d，其中第2d时DCA13产量达到最高，此后DCA13含量下降至低于检测限，而相应C11、C9、C7以及C5二元酸含量逐渐升高。不同表面活性剂吐温60、RL和HG50RL分别单独添加到C13转化培养基时对C13乳化率作用依次增强；但在接种C.viswanathii后，RL和HG50RL两组的C13乳化率均低于吐温60组，表明鼠李糖脂类对DCA13产生菌及其吸收过程有较强的抑制作用。为此，选用异构十三醇(Exxal C13)作为助表面活性剂，发酵2d的C.viswanathii粗酶液为水相来源，构建了上述不同表面活性剂/ExxalC13/C13/粗酶液四元逆胶束酶催化体系，结果显示由HG50RL参与构成的逆胶束酶催化体系DCA13产量较高，比相同条件下使用传统吐温60工艺提高了12%。
以上研究初步实现了生物表面活性剂在DCA13生物转化生产体系中的新应用。