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乳腺癌是在全球女性人群中高发的一种恶性肿瘤，传统放化疗治疗效果不佳，手术治疗对患者心理健康有影响且也易转移复发。免疫治疗应用于乳腺癌的临床研究近几年来取得了令人欣慰的结果，然而该疗法只针对少部分患者(约10-20%)有效，大部分病人并不能从中受益。为了增强免疫治疗的效果，各种联合治疗手段得到了广泛的关注。声动力治疗(Sonodynamic therapy, SDT)是一种相对无创的技术手段，其穿透能力强、对周围组织损伤小，因而成为一个较为理想的局部治疗方式。钙离子参与生物体的各种生理过程，其稳态的维持对细胞进行正常的生命活动至关重要，钙超载被认为是引起细胞死亡的一大诱因。因此，本文将声动力协同钙超载与免疫检查点阻断结合，以提高乳腺癌治疗效果。本论文开展的主要研究工作及结果如下：
1.本研究制备得到外表面包覆磷酸钙(Calcium phosphate, CaP)的二氧化钛纳米粒(表示为TiO2@CaP)。通过透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射仪(XRD)和场发射扫描电子显微镜(FSEM)，我们对TiO2@CaP的形态结构和元素组成进行了表征分析。利用原子吸收光谱(ICP-MS)检测钙离子，结果显示，与中性条件(pH=7.4)相比，CaP在酸性条件(pH=6.5和pH=5.0)下释放更多的钙离子。利用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)探针，我们检测了TiO2@CaP在超声条件下产生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的能力，结果显示TiO2@CaP能够有效产生ROS。
2.体外细胞活性实验证实，TiO2@CaP纳米粒的生物相容性较好。在超声条件下，TiO2和TiO2@CaP纳米粒均对4T1肿瘤细胞有杀伤作用，并且随着其浓度的升高而增强，但TiO2@CaP纳米粒中由于钙的存在，其杀伤效果更强。通过流式细胞仪和ELISA分别检测钙网蛋白(Calreticulin, CRT)、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1, HMGB1)和ATP的变化，我们发现经TiO2@CaP超声处理后，肿瘤细胞CRT、HMGB1、ATP的水平均显著上调，说明基于TiO2@CaP的声动力治疗(TiO2@CaP-SDT)导致肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death,ICD)。TiO2@CaP纳米粒与4T1细胞共孵育4h后，通过激光共聚焦显微镜观察及流式细胞仪定量，我们发现TiO2@CaP纳米粒使细胞内钙离子浓度显著升高。
3.通过建立小鼠4T1皮下瘤模型，我们证明TiO2@CaP-SDT能够有效激活小鼠机体免疫系统。经TiO2@CaP-SDT治疗后第3天，通过流式细胞仪检测，我们发现肿瘤引流淋巴结中成熟活化的树突状细胞比例显著升高，表明TiO2@CaP-SDT诱导产生了肿瘤相关抗原，激活了树突细胞。
4.通过体内实验，我们证明了TiO2@CaP-SDT联合免疫检查点抑制剂PD-1对乳腺癌的治疗效果。相比于其他对照组，TiO2@CaP-SDT联合治疗组的肿瘤生长速度明显减缓。流式细胞仪分析显示，肿瘤微环境中特异性T细胞的浸润增加。ELISA实验结果也证实，血清中主要的抗肿瘤细胞因子IFN-γ、TNF-α的水平明显上升。另外，在4T1双侧皮下瘤模型中，TiO2@CaP-SDT联合疗法对远端肿瘤也表现出一定的抑制效果，表明TiO2@CaP-SDT联合免疫治疗引起的全身性免疫应答可以抑制远端肿瘤的生长，对肿瘤的转移有一定的预防作用。
综上所述，本文所使用的声敏剂TiO2@CaP能够在超声作用下产生ROS。同时，在超声条件下，磷酸钙的存在能够显著上调肿瘤细胞内钙离子水平，产生钙超载，两者发挥相互协同的作用，诱导免疫原性细胞死亡。PD-1抗体的加入改善了肿瘤内部的免疫抑制微环境，联合治疗显著提高抑瘤效果。同时，免疫系统的激活对余下及远端的肿瘤发挥杀伤作用。总之，TiO2@CaP-SDT联合免疫治疗在动物模型中展现出较为理想的效果，有望为乳腺癌的临床治疗提供一种可行且有效的治疗手段。
1.本研究制备得到外表面包覆磷酸钙(Calcium phosphate, CaP)的二氧化钛纳米粒(表示为TiO2@CaP)。通过透射电子显微镜(TEM)、X射线衍射仪(XRD)和场发射扫描电子显微镜(FSEM)，我们对TiO2@CaP的形态结构和元素组成进行了表征分析。利用原子吸收光谱(ICP-MS)检测钙离子，结果显示，与中性条件(pH=7.4)相比，CaP在酸性条件(pH=6.5和pH=5.0)下释放更多的钙离子。利用1,3-二苯基异苯并呋喃(DPBF)探针，我们检测了TiO2@CaP在超声条件下产生活性氧(Reactive oxygen species, ROS)的能力，结果显示TiO2@CaP能够有效产生ROS。
2.体外细胞活性实验证实，TiO2@CaP纳米粒的生物相容性较好。在超声条件下，TiO2和TiO2@CaP纳米粒均对4T1肿瘤细胞有杀伤作用，并且随着其浓度的升高而增强，但TiO2@CaP纳米粒中由于钙的存在，其杀伤效果更强。通过流式细胞仪和ELISA分别检测钙网蛋白(Calreticulin, CRT)、高迁移率族蛋白B1(High mobility group protein B1, HMGB1)和ATP的变化，我们发现经TiO2@CaP超声处理后，肿瘤细胞CRT、HMGB1、ATP的水平均显著上调，说明基于TiO2@CaP的声动力治疗(TiO2@CaP-SDT)导致肿瘤细胞发生免疫原性细胞死亡(Immunogenic cell death,ICD)。TiO2@CaP纳米粒与4T1细胞共孵育4h后，通过激光共聚焦显微镜观察及流式细胞仪定量，我们发现TiO2@CaP纳米粒使细胞内钙离子浓度显著升高。
3.通过建立小鼠4T1皮下瘤模型，我们证明TiO2@CaP-SDT能够有效激活小鼠机体免疫系统。经TiO2@CaP-SDT治疗后第3天，通过流式细胞仪检测，我们发现肿瘤引流淋巴结中成熟活化的树突状细胞比例显著升高，表明TiO2@CaP-SDT诱导产生了肿瘤相关抗原，激活了树突细胞。
4.通过体内实验，我们证明了TiO2@CaP-SDT联合免疫检查点抑制剂PD-1对乳腺癌的治疗效果。相比于其他对照组，TiO2@CaP-SDT联合治疗组的肿瘤生长速度明显减缓。流式细胞仪分析显示，肿瘤微环境中特异性T细胞的浸润增加。ELISA实验结果也证实，血清中主要的抗肿瘤细胞因子IFN-γ、TNF-α的水平明显上升。另外，在4T1双侧皮下瘤模型中，TiO2@CaP-SDT联合疗法对远端肿瘤也表现出一定的抑制效果，表明TiO2@CaP-SDT联合免疫治疗引起的全身性免疫应答可以抑制远端肿瘤的生长，对肿瘤的转移有一定的预防作用。
综上所述，本文所使用的声敏剂TiO2@CaP能够在超声作用下产生ROS。同时，在超声条件下，磷酸钙的存在能够显著上调肿瘤细胞内钙离子水平，产生钙超载，两者发挥相互协同的作用，诱导免疫原性细胞死亡。PD-1抗体的加入改善了肿瘤内部的免疫抑制微环境，联合治疗显著提高抑瘤效果。同时，免疫系统的激活对余下及远端的肿瘤发挥杀伤作用。总之，TiO2@CaP-SDT联合免疫治疗在动物模型中展现出较为理想的效果，有望为乳腺癌的临床治疗提供一种可行且有效的治疗手段。