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目的：IL-37是一种具有抗炎以及调节免疫作用的细胞因子，现有的研究发现在子宫内膜异位症患者中IL-37的表达增加。本研究将通过动物实验以及体外实验来探究IL-37异构体中目前被研究最多的IL-37b在子宫内膜异位病灶早期形成和生长中的作用。
方法：(1)使用腹腔注射子宫碎片的方法来构建子宫内膜异位症小鼠模型，在造模后第1、3、5以及7天，将小鼠脱颈处死，观察腹腔中是否存在未黏附的子宫组织块来确定病灶形成的时间。为了检测IL-37b是否可以影响此疾病的发生发展，从造模3天前开始腹腔注射rhIL-37b细胞因子，对照组小鼠注射同体积的PBS，于造模后第3天、第7天以及第14天处死小鼠，分别记录每组每只小鼠的病灶数量、大小以及重量。接下来为了进一步检测IL-37b分别对病灶早期形成与生长的影响，于病灶早期形成阶段(到造模第3天)和病灶生长阶段(从造模后第3天开始)腹腔注射rhIL-37b，对照组注射同体积的PBS，分别记录实验终止时每组每只小鼠的病灶数量、大小以及重量。(2)为了探究rhIL-37b是否通过巨噬细胞来影响病灶的形成或者生长，分别于病灶早期形成阶段和病灶生长阶段腹腔注射rhIL-37b或/和ClodronateLiposomes(巨噬细胞清除剂)，对照组注射PBS，记录实验终止时每组每只小鼠的病灶数量、大小以及重量。(3)检测IL-37b对异位病灶组织增殖、侵袭和血管生成的影响。免疫组化鉴定对照组和rhIL-37b组病灶组织中增殖标志物PCNA的表达。定量PCR检测在造模第3天以及第14天时两组病灶组织中与侵袭和血管生成相关的因子MMP2、MMP9和VEGF-A的基因表达。免疫组化和ELISA分别检测两组病灶组织、腹腔液中MMP9和VEGF的表达。(4)检测IL-37b对异位病灶组织炎症因子表达的影响。定量PCR检测在造模第3天以及第14天时两组病灶组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1以及IL-37b受体的基因表达。IL-37b受体包括IL-18Rα和IL-1R8(也叫做SIGIRR)。ELISA检测两组小鼠腹腔液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β1的含量。(5)体外培养小鼠子宫组织块，加不同浓度的rhIL-37b处理3天。定量PCR鉴定各组子宫组织块中MMP2、MMP9、VEGF-A、炎症因子以及IL-37b受体的基因表达。信号蛋白Akt和Erk1/2参与增殖、侵袭、血管生成以及炎症过程。WesternBlot鉴定各组Akt、p-Akt、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的表达水平。(6)体外分离和培养小鼠子宫内膜基质细胞，细胞免疫组化鉴定角蛋白和波形蛋白的表达。加不同浓度的rhIL-37b处理24小时，检测细胞增殖、侵袭能力的变化；定量PCR检测MMP2、MMP9、VEGF-A、炎症因子以及IL-37b受体的基因表达。(7)将pIL-37b或者pcDNA3.1质粒转染至小鼠子宫内膜基质细胞，PCR以及WesternBlot鉴定IL-37b的表达。检测转染pcDNA3.1或者pIL-37b质粒48小时后的基质细胞的增殖、侵袭能力、基因表达(MMP2、MMP9、VEGF-A、炎症因子以及IL-37b受体)以及信号蛋白Akt和Erk1/2的磷酸化水平。(8)培养人子宫内膜腺癌细胞株RL95-2细胞，加不同浓度的rhIL-37b处理24小时，检测细胞增殖能力的变化，定量PCR检测各组细胞中MMP2、IL-8、VEGF-A、炎症因子和IL-37b受体的基因表达。
结果：(1)在造模后第1天，腹腔内可以看到未黏附的子宫组织块以及已经形成的红色异位病灶，而从第3天开始腹腔内均未见游离的子宫碎片，提示在造模后第3天子宫碎片已经黏附，并形成异位病灶。与对照组相比，rhIL-37b处理组的病灶数量、面积以及重量在造模后第14天均显著降低。进一步的实验结果显示：与对照组相比，在病灶形成阶段，rhIL-37b组的病灶数量、面积以及重量没有显著改变；而在病灶发展阶段，rhIL-37b组的病灶数量、面积以及重量均显著降低。以上结果提示rhIL-37b通过抑制病灶的生长，而不是病灶形成，来影响该疾病的发展。病灶组织的H&E染色可见明显的子宫内膜上皮细胞以及基质细胞，即证实为异位的子宫内膜。(2)在病灶形成阶段，结果显示：与对照组(只注射PBS组)相比，Clo组(只注射ClodronateLiposomes组)、rhIL-37b+Clo组(即注射rhIL-37b又注射ClodronateLiposomes组)的病灶数量、面积和重量均显著减少，而和rhIL-37b组(只注射rhIL-37b组)之间无差异。此外，Clo组和rhIL-37b+Clo组之间病灶数量、面积和重量均并无显著差异。实验结果提示巨噬细胞参与早期病灶的形成，而rhIL-37b不仅对病灶早期形成没有影响，而且对此阶段巨噬细胞的作用也没有影响。在病灶发展阶段，结果显示：在造模第14天时，与对照组相比，Clo组病灶的数量、面积和重量均无显著差异，而rhIL-37b组和rhIL-37b+Clo组的病灶数量、面积和重量均显著减少。此外，rhIL-37b组和rhIL-37b+Clo组之间病灶数量、面积和重量也无显著差异。以上实验结果提示rhIL-37b并不是通过巨噬细胞来抑制病灶生长。(3)异位病灶的定量PCR结果显示：与对照组相比，在造模后第3天以及第14天时rhIL-37b处理组中Mmp2、Mmp9以及VegfamRNA均表达下降。免疫组化的结果显示：rhIL-37b处理组中MMP9、VEGF以及PCNA的表达降低。腹腔液ELISA结果显示：rhIL-37b处理组腹腔液中MMP9的含量低于对照组。以上结果提示rhIL-37b可以抑制病灶组织的增殖、侵袭以及血管生成。(4)病灶定量PCR结果显示：与对照组相比，在造模后第3天，rhIL-37b处理组的病灶组织中Il1b、Il6、Tnfa、Il10以及Il18r1mRNA均表达下降，而Tgfb1mRNA表达上升；在造模后第14天，rhIL-37b处理组的病灶组织中Il1b、Il6、Tnfa、Il10、Tgfb1以及Il18r1mRNA均表达下降，而受体SigirrmRNA表达上升。腹腔液ELISA结果显示：与对照组相比，rhIL-37b处理组腹腔液中TNF-α的浓度低于对照组。以上结果提示rhIL-37b可以抑制病灶组织炎症因子的表达。(5)小鼠子宫组织块的H&E染色结果显示：体外培养24小时以及48小时后，组织块内仍可见明显的上皮细胞层。组织切片的免疫组化的结果证实体外培养4天后组织块仍表达波形蛋白以及角蛋白。定量PCR结果显示：体外培养的子宫组织给予rhIL-37b处理后，Tgfb1mRNA的表达上调，Mmp9、Vegfa、Il1b和Il18r1mRNA表达下调,提示rhIL-37b直接抑制子宫组织块中与侵移、血管生成以及促炎相关的因子的表达。此外，rhIL-37b处理可以显著抑制子宫组织中信号蛋白Akt和Erk1/2的磷酸化水平。(6)提取的小鼠子宫内膜基质细胞表达波形蛋白，且几乎不表达角蛋白，即证实所提取的细胞即为子宫内膜基质细胞。CCK-8和Transwell实验结果分别证实给予rhIL-37b处理可以抑制基质细胞的增殖和侵袭。定量PCR的结果显示：rhIL-37b处理可以下调基质细胞中Vegfa、Mmp9、Il1b、Il6、Tnfa、Il10和Il18r1mRNA的表达，上调Tgfb1和SigirrmRNA表达。(7)定量PCR以及WesternBlot结果证实转染pIL-37b质粒后的基质细胞表达IL-37b，而转染pIL-37b质粒的载体质粒pcDNA3.1的细胞则仍不能。转染48小时后，与转染pcDNA3.1的细胞相比，转染pIL-37b质粒的基质细胞增殖和侵袭能力降低。定量PCR结果显示：与pcDNA3.1组相比，转染pIL-37b质粒后的基质细胞中Mmp2、Mmp9、Vegfa、Il1b、Il6、Tnfa、Il10以及Il18r1mRNA均表达下降，Tgfb1和SigirrmRNA表达上升。WesternBlot结果显示转染pIL-37b质粒后的基质细胞p-Akt/Akt以及p-Erk1/2/Erk1/2的比例均显著降低。(8)CCK-8结果证实rhIL-37b可以抑制RL95-2细胞增殖。定量PCR
结果证实rhIL-37b处理可以上调RL95-2细胞中TGFB1mRNA的表达，下调MMP9、VEGFA、CXCL8、IL1B、TNFA、IL10以及受体IL18R1mRNA的表达。
结论：IL-37b可能通过Akt和Erk1/2信号通路调节子宫内膜细胞的增殖、侵袭、血管生成以及炎症进展从而抑制异位病灶的生长。
方法：(1)使用腹腔注射子宫碎片的方法来构建子宫内膜异位症小鼠模型，在造模后第1、3、5以及7天，将小鼠脱颈处死，观察腹腔中是否存在未黏附的子宫组织块来确定病灶形成的时间。为了检测IL-37b是否可以影响此疾病的发生发展，从造模3天前开始腹腔注射rhIL-37b细胞因子，对照组小鼠注射同体积的PBS，于造模后第3天、第7天以及第14天处死小鼠，分别记录每组每只小鼠的病灶数量、大小以及重量。接下来为了进一步检测IL-37b分别对病灶早期形成与生长的影响，于病灶早期形成阶段(到造模第3天)和病灶生长阶段(从造模后第3天开始)腹腔注射rhIL-37b，对照组注射同体积的PBS，分别记录实验终止时每组每只小鼠的病灶数量、大小以及重量。(2)为了探究rhIL-37b是否通过巨噬细胞来影响病灶的形成或者生长，分别于病灶早期形成阶段和病灶生长阶段腹腔注射rhIL-37b或/和ClodronateLiposomes(巨噬细胞清除剂)，对照组注射PBS，记录实验终止时每组每只小鼠的病灶数量、大小以及重量。(3)检测IL-37b对异位病灶组织增殖、侵袭和血管生成的影响。免疫组化鉴定对照组和rhIL-37b组病灶组织中增殖标志物PCNA的表达。定量PCR检测在造模第3天以及第14天时两组病灶组织中与侵袭和血管生成相关的因子MMP2、MMP9和VEGF-A的基因表达。免疫组化和ELISA分别检测两组病灶组织、腹腔液中MMP9和VEGF的表达。(4)检测IL-37b对异位病灶组织炎症因子表达的影响。定量PCR检测在造模第3天以及第14天时两组病灶组织中炎症因子IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10、TGF-β1以及IL-37b受体的基因表达。IL-37b受体包括IL-18Rα和IL-1R8(也叫做SIGIRR)。ELISA检测两组小鼠腹腔液中IL-1β、IL-6、TNF-α、IL-10和TGF-β1的含量。(5)体外培养小鼠子宫组织块，加不同浓度的rhIL-37b处理3天。定量PCR鉴定各组子宫组织块中MMP2、MMP9、VEGF-A、炎症因子以及IL-37b受体的基因表达。信号蛋白Akt和Erk1/2参与增殖、侵袭、血管生成以及炎症过程。WesternBlot鉴定各组Akt、p-Akt、Erk1/2和p-Erk1/2蛋白的表达水平。(6)体外分离和培养小鼠子宫内膜基质细胞，细胞免疫组化鉴定角蛋白和波形蛋白的表达。加不同浓度的rhIL-37b处理24小时，检测细胞增殖、侵袭能力的变化；定量PCR检测MMP2、MMP9、VEGF-A、炎症因子以及IL-37b受体的基因表达。(7)将pIL-37b或者pcDNA3.1质粒转染至小鼠子宫内膜基质细胞，PCR以及WesternBlot鉴定IL-37b的表达。检测转染pcDNA3.1或者pIL-37b质粒48小时后的基质细胞的增殖、侵袭能力、基因表达(MMP2、MMP9、VEGF-A、炎症因子以及IL-37b受体)以及信号蛋白Akt和Erk1/2的磷酸化水平。(8)培养人子宫内膜腺癌细胞株RL95-2细胞，加不同浓度的rhIL-37b处理24小时，检测细胞增殖能力的变化，定量PCR检测各组细胞中MMP2、IL-8、VEGF-A、炎症因子和IL-37b受体的基因表达。
结果：(1)在造模后第1天，腹腔内可以看到未黏附的子宫组织块以及已经形成的红色异位病灶，而从第3天开始腹腔内均未见游离的子宫碎片，提示在造模后第3天子宫碎片已经黏附，并形成异位病灶。与对照组相比，rhIL-37b处理组的病灶数量、面积以及重量在造模后第14天均显著降低。进一步的实验结果显示：与对照组相比，在病灶形成阶段，rhIL-37b组的病灶数量、面积以及重量没有显著改变；而在病灶发展阶段，rhIL-37b组的病灶数量、面积以及重量均显著降低。以上结果提示rhIL-37b通过抑制病灶的生长，而不是病灶形成，来影响该疾病的发展。病灶组织的H&E染色可见明显的子宫内膜上皮细胞以及基质细胞，即证实为异位的子宫内膜。(2)在病灶形成阶段，结果显示：与对照组(只注射PBS组)相比，Clo组(只注射ClodronateLiposomes组)、rhIL-37b+Clo组(即注射rhIL-37b又注射ClodronateLiposomes组)的病灶数量、面积和重量均显著减少，而和rhIL-37b组(只注射rhIL-37b组)之间无差异。此外，Clo组和rhIL-37b+Clo组之间病灶数量、面积和重量均并无显著差异。实验结果提示巨噬细胞参与早期病灶的形成，而rhIL-37b不仅对病灶早期形成没有影响，而且对此阶段巨噬细胞的作用也没有影响。在病灶发展阶段，结果显示：在造模第14天时，与对照组相比，Clo组病灶的数量、面积和重量均无显著差异，而rhIL-37b组和rhIL-37b+Clo组的病灶数量、面积和重量均显著减少。此外，rhIL-37b组和rhIL-37b+Clo组之间病灶数量、面积和重量也无显著差异。以上实验结果提示rhIL-37b并不是通过巨噬细胞来抑制病灶生长。(3)异位病灶的定量PCR结果显示：与对照组相比，在造模后第3天以及第14天时rhIL-37b处理组中Mmp2、Mmp9以及VegfamRNA均表达下降。免疫组化的结果显示：rhIL-37b处理组中MMP9、VEGF以及PCNA的表达降低。腹腔液ELISA结果显示：rhIL-37b处理组腹腔液中MMP9的含量低于对照组。以上结果提示rhIL-37b可以抑制病灶组织的增殖、侵袭以及血管生成。(4)病灶定量PCR结果显示：与对照组相比，在造模后第3天，rhIL-37b处理组的病灶组织中Il1b、Il6、Tnfa、Il10以及Il18r1mRNA均表达下降，而Tgfb1mRNA表达上升；在造模后第14天，rhIL-37b处理组的病灶组织中Il1b、Il6、Tnfa、Il10、Tgfb1以及Il18r1mRNA均表达下降，而受体SigirrmRNA表达上升。腹腔液ELISA结果显示：与对照组相比，rhIL-37b处理组腹腔液中TNF-α的浓度低于对照组。以上结果提示rhIL-37b可以抑制病灶组织炎症因子的表达。(5)小鼠子宫组织块的H&E染色结果显示：体外培养24小时以及48小时后，组织块内仍可见明显的上皮细胞层。组织切片的免疫组化的结果证实体外培养4天后组织块仍表达波形蛋白以及角蛋白。定量PCR结果显示：体外培养的子宫组织给予rhIL-37b处理后，Tgfb1mRNA的表达上调，Mmp9、Vegfa、Il1b和Il18r1mRNA表达下调,提示rhIL-37b直接抑制子宫组织块中与侵移、血管生成以及促炎相关的因子的表达。此外，rhIL-37b处理可以显著抑制子宫组织中信号蛋白Akt和Erk1/2的磷酸化水平。(6)提取的小鼠子宫内膜基质细胞表达波形蛋白，且几乎不表达角蛋白，即证实所提取的细胞即为子宫内膜基质细胞。CCK-8和Transwell实验结果分别证实给予rhIL-37b处理可以抑制基质细胞的增殖和侵袭。定量PCR的结果显示：rhIL-37b处理可以下调基质细胞中Vegfa、Mmp9、Il1b、Il6、Tnfa、Il10和Il18r1mRNA的表达，上调Tgfb1和SigirrmRNA表达。(7)定量PCR以及WesternBlot结果证实转染pIL-37b质粒后的基质细胞表达IL-37b，而转染pIL-37b质粒的载体质粒pcDNA3.1的细胞则仍不能。转染48小时后，与转染pcDNA3.1的细胞相比，转染pIL-37b质粒的基质细胞增殖和侵袭能力降低。定量PCR结果显示：与pcDNA3.1组相比，转染pIL-37b质粒后的基质细胞中Mmp2、Mmp9、Vegfa、Il1b、Il6、Tnfa、Il10以及Il18r1mRNA均表达下降，Tgfb1和SigirrmRNA表达上升。WesternBlot结果显示转染pIL-37b质粒后的基质细胞p-Akt/Akt以及p-Erk1/2/Erk1/2的比例均显著降低。(8)CCK-8结果证实rhIL-37b可以抑制RL95-2细胞增殖。定量PCR
结果证实rhIL-37b处理可以上调RL95-2细胞中TGFB1mRNA的表达，下调MMP9、VEGFA、CXCL8、IL1B、TNFA、IL10以及受体IL18R1mRNA的表达。
结论：IL-37b可能通过Akt和Erk1/2信号通路调节子宫内膜细胞的增殖、侵袭、血管生成以及炎症进展从而抑制异位病灶的生长。