论文部分内容阅读
运动节律性调控各类重要生理活动，如行走步态、咀嚼、呼吸等。消化系统中，节律性排便行为作为直接调节代谢物的重要途径，是生命活动中不可或缺的一环。研究排便节律调控机制对理解生物节律形成和治疗节律失调症(如便秘等)具有重要意义。秀丽隐杆线虫(简称线虫)具有严格的排便周期性，且每一周期包含精确的步骤程序(包括前体壁肌收缩aBoc,后体壁肌收缩pBoc,肠道排出Exp)。与哺乳动物相比，线虫的排便节律周期时程短、步骤简单，但和哺乳动物一样，该节律受到精确的肠道和神经信号调控。本文以线虫作为模型，研究节律性排便的细胞分子调控机制。
论文中，利用已知的排便障碍突变体nlp-40(tm4085)和aex-2(sa3)，筛选出功能未知的新功能基因twk-40，发现twk-40功能缺失型突变体twk-40(hp834, lf)可以改善nlp-40(tm4085)和aex-2(sa3)突变体Exp节律失调，说明twk-40调节线虫排便节律。意外的是，twk-40(lf)突变体本身，并没有表现出Exp节律异常，但制备的功能增强型突变体twk-40(bln336, gf)导致了严重的Exp缺陷。通过荧光共定位实验，我们观察到twk-40基因表达在调节线虫节律排便关键神经元DVB上。进一步，在DVB神经元上表达野生型TWK-40(WT)，可以部分恢复twk-40(gf)突变体的Exp缺陷表型。在野生型或twk-40(lf)突变体的DVB神经元表达TWK-40(bln336, GF)，可以模拟twk-40(gf)突变体的Exp缺陷表型。以上实验说明，twk-40可能调节线虫DVB活性操控排便节律。随后，在DVB神经元和与DVB形成突触功能连接的肠道肌肉中，分别表达钙敏感蛋白GCaMP6.0s，我们观察到强烈的节律钙震荡活性与Exp同步发生。进一步，我们发现twk-40(gf)严重抑制了DVB神经元的钙震荡频率和幅值。相反，twk-40(lf)导致DVB神经元和肠道肌肉中的钙震荡频率上升，但不改变钙震荡幅值。神经元特异性拯救和过表达实验结合实时钙成像，再次验证了twk-40基因细胞自主性地(cell-autonomously)调节DVB神经元活性，从而调控节律性排便。最后，我们将twk-40基因外源表达在HEK293细胞上，全细胞记录发现TWK-40产生一个外向钾通道电流，超级化细胞膜静息电位。功能增强型突变体TWK-40(bln336, GF)产生更强的外向电流和更低的静息膜电位。
综上，本文研究twk-40基因调控线虫节律性排便的细胞机制。twk-40的功能增强性突变，会导致DVB神经元的双孔钾通道电流增加，使细胞处于超极化，抑制神经元兴奋性，并进一步抑制肠道肌肉的兴奋性，最终导致线虫出现Exp缺陷表型。本文的研究结果为进一步研究节律性排便提供一定的基础，同时为排便节律异常导致的生理疾病治疗提供借鉴。
论文中，利用已知的排便障碍突变体nlp-40(tm4085)和aex-2(sa3)，筛选出功能未知的新功能基因twk-40，发现twk-40功能缺失型突变体twk-40(hp834, lf)可以改善nlp-40(tm4085)和aex-2(sa3)突变体Exp节律失调，说明twk-40调节线虫排便节律。意外的是，twk-40(lf)突变体本身，并没有表现出Exp节律异常，但制备的功能增强型突变体twk-40(bln336, gf)导致了严重的Exp缺陷。通过荧光共定位实验，我们观察到twk-40基因表达在调节线虫节律排便关键神经元DVB上。进一步，在DVB神经元上表达野生型TWK-40(WT)，可以部分恢复twk-40(gf)突变体的Exp缺陷表型。在野生型或twk-40(lf)突变体的DVB神经元表达TWK-40(bln336, GF)，可以模拟twk-40(gf)突变体的Exp缺陷表型。以上实验说明，twk-40可能调节线虫DVB活性操控排便节律。随后，在DVB神经元和与DVB形成突触功能连接的肠道肌肉中，分别表达钙敏感蛋白GCaMP6.0s，我们观察到强烈的节律钙震荡活性与Exp同步发生。进一步，我们发现twk-40(gf)严重抑制了DVB神经元的钙震荡频率和幅值。相反，twk-40(lf)导致DVB神经元和肠道肌肉中的钙震荡频率上升，但不改变钙震荡幅值。神经元特异性拯救和过表达实验结合实时钙成像，再次验证了twk-40基因细胞自主性地(cell-autonomously)调节DVB神经元活性，从而调控节律性排便。最后，我们将twk-40基因外源表达在HEK293细胞上，全细胞记录发现TWK-40产生一个外向钾通道电流，超级化细胞膜静息电位。功能增强型突变体TWK-40(bln336, GF)产生更强的外向电流和更低的静息膜电位。
综上，本文研究twk-40基因调控线虫节律性排便的细胞机制。twk-40的功能增强性突变，会导致DVB神经元的双孔钾通道电流增加，使细胞处于超极化，抑制神经元兴奋性，并进一步抑制肠道肌肉的兴奋性，最终导致线虫出现Exp缺陷表型。本文的研究结果为进一步研究节律性排便提供一定的基础，同时为排便节律异常导致的生理疾病治疗提供借鉴。