【摘 要】
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目的：柯萨奇B组病毒(coxsackievirus group B，CVB)是人类病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的主要病原。研究证明，约有25％CVB性心肌炎最终演变为扩张型心肌病(dilated cardiomy
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目的：柯萨奇B组病毒(coxsackievirus group B，CVB)是人类病毒性心肌炎(viral myocarditis，VMC)的主要病原。研究证明，约有25％CVB性心肌炎最终演变为扩张型心肌病(dilated cardiomyopathy，DCM)。目前临床对CVB感染尚无特异、有效的治疗措施。近年来，一氧化氮(nitric oxide，NO)的抗病毒作用受到了广泛的关注，诱导型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase iNOS)在各种因子存在的条件下将精氨酸和氧气催化为胍氨酸和一氧化氮；CVB3的衣壳蛋白VP1是其主要的中和抗原。本研究通过构建iNOS基因和iNOS与VP1融和基因的真核表达载体，研究iNOS以及iNOS-VP1融和蛋白的抗病毒作用，为抗柯萨奇病毒开辟了新的生物治疗的思路。
方法：应用PCR扩增和DNA重组技术构建pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1真核表达载体；应用限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序技术证实pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1表达载体所插入片段的大小和方向的正确性；应用真核细胞转染技术及间接免疫荧光技术进行所构建的真核表达载体的初步表达和荧光鉴定。
结果：经PCR扩增技术用特异引物从质粒pKSiNOS分离编码iNOS开放阅读框架的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将插入片断亚克隆于表达载体pcDNA3.1，成功构建iNOS的真核表达载体pcDNA3.1-iNOS；经PCR扩增技术用特异引物从质粒pCR2.1-VP1分离编码CVB3VP1结构蛋白的cDNA，TA克隆于pMD19-T载体，根据设计引物时加入的酶切位点将VP1亚克隆于iNOS的表达载体pcDNA3.1-iNOS，从而构建含有iNOS和VP1融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-iNOS-VP1。限制性内切酶分析、PCR鉴定和测序证实重组体pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1插入片断的大小和方向正确且开放阅读框架的读码框不变；重组质粒pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1在HeLa细胞中均有表达，但表达效率较低。
结论：分别获得含iNOS基因和iNOS-VP1融合基因的真核表达载体pcDNA3.1-iNOS和pcDNA3.1-iNOS-VP1，并将重组质粒在HeLa细胞中进行了初步表达，为体外iNOS抗CVB3作用的研究奠定了物质基础。
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