论文部分内容阅读
银纳米颗粒(AgNP)独特的抗菌性质使其在生活的方方面面得到广泛使用，从而增加了人类和环境的暴露机会。因此，AgNP暴露对生物和环境安全性的影响引起了人们的广泛重视。有研究报道，AgNP暴露细胞可以引起一系列的细胞毒性。为了更加全面地评价AgNP的毒性效应及其机制，我们在本论文中系统地研究了AgNP的细胞毒性，基因毒性和AgNP引起毒性的机制。 本论文包括三部分。在第一部分中，我们主要研究了AgNP(BSA表面修饰，粒径15.9±7.6nm)对中国仓鼠卵巢细胞(CHO-K1)的细胞毒性和基因毒性。在第二部分中，我们系统地研究了AgNP在CHO-K1细胞内的摄入、细胞内降解和转化的过程。第三部分比较了金纳米棒表面包覆银壳的双金属纳米颗粒(Au@AgNR)对大鼠卵巢颗粒细胞(granulosecells，GC)的细胞毒性和激素分泌的影响。 我们在第一部分中采用经济合作与发展组织(OrganizationforEconomicCo-operationandDevelopment，OECD)推荐的CHO-K1作为研究基因毒性的细胞模型，评价了AgNP的细胞毒性和基因毒性——包括其对DNA和染色体的损伤。实验结果表明，AgNP或Ag+(1-20μg/ml)暴露CHO-K1细胞24h后，引起了浓度依赖性的细胞活力的显著下降和细胞内氧化应激水平的提高。同时，细胞周期中亚G1期细胞比例明显增加，这一现象与细胞凋亡坏死的检测结果相一致（AgNP的暴露引起了CHO-K1细胞的凋亡）。我们采用32P后标记法检测DNA加合物，DNA氧化损伤标志物8-羟基脱氧鸟甘(8-oxodG)定量地分析了AgNP对CHO-K1细胞造成的DNA损伤，并用微核（由染色体畸变产生）试验评估了AgNP对于CHO-K1细胞中染色体的影响。实验结果显示，AgNP或Ag+暴露都能引起浓度依赖性的细胞内DNA加合物增加，8-oxodG含量增加以及微核的产生。在相同的银元素浓度下，AgNP和Ag+引起的DNA损伤和染色体畸变的程度并不相同，说明AgNP和Ag+引起基因毒性的机制有所不同。 第二部分，为了研究AgNP引起这一系列细胞和基因毒性的原因，我们利用电感耦合等离子体质谱(ICP-MS)和X射线近边吸收谱学(XANES)的方法，系统地研究了AgNP在CHO-K1细胞内的摄入、降解和转化过程。实验结果表明，AgNP主要通过脂筏介导的内吞方式入胞。进入细胞后的AgNP快速降解，首先氧化成Ag-O的中间产物，最后转化成与硫配位的Ag-S形式稳定存在于细胞内。用抗氧化剂和Ag+螯合剂N-乙酰-L-半胱氨酸(NAC)预孵育细胞，可以明显地降低AgNP和Ag+引起的细胞毒性，说明AgNP引起的细胞毒性与细胞内Ag+的释放和活性氧的产生有关。 第三部分，鉴于纳米银在很多妇科抗炎药品和避孕产品中的应用，急需评价其对生殖系统的影响。因此，我们提取大鼠原代卵巢颗粒细胞(GC)作为研究模型，评价了纳米银对生殖系统的毒性。本研究比较了金纳米棒(AuNR)以及金纳米棒表面包覆银壳的双金属纳米颗粒(Au@AgNR)在大鼠GC内引起的细胞毒性，以及两种纳米颗粒对于GC激素分泌的影响。研究发现，Au@AgNR能明显地导致大鼠GC的细胞凋亡，而AuNR却没有明显的细胞毒性。这说明毒性主要来自于Au@AgNR表面的Ag。有意思的是，我们发现AuNR上调了激素分泌相关酶的表达。这部分的研究工作还在进行中，具体的分子机制还需要进一步的探讨。 综合以上实验结果，我们发现AgNP暴露可导致CHO-K1细胞活力下降，细胞内活性氧水平提高，细胞周期阻滞和细胞凋亡。从基因毒性的角度来看，AgNP引起了DNA和染色体的损伤，增加了细胞内DNA加合物，8-oxodG和微核的含量。AgNP通过脂筏介导的内吞途径进入细胞，在细胞内很快地降解，首先被氧化成Ag-O配位的形式，最后以Ag-S的形式稳定存在于细胞内。因此我们推断，AgNP的细胞毒性是由于AgNP在细胞内释放Ag+导致的，释放的Ag+很可能是通过与细胞内含巯基(-SH)的生物分子（氨基酸或蛋白质等）相结合，影响了蛋白质（包括一些酶类）的功能以及细胞内的氧化还原平衡，进而造成DNA的氧化损伤和染色体的断裂。通过比较AuNR和Au@AgNR在大鼠GC内引起的细胞毒性和其对GC激素分泌的影响，我们发现AuNR具有很好的生物相容性，而Au@AgNR引起了明显的细胞毒性和细胞凋亡，说明毒性主要来自于Au@AgNR表面的Ag。