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鱼类细胞系作为理想的体外研究模型，已经成为鱼类生物学研究不可或缺的工具，各个物种不同组织特异性细胞系的分离将为该物种生理学、毒理学、病毒学、基因功能分析、种质资源保护及转基因等领域研究提供特异的、基础的、低成本的研究材料。中华鲟(Acipenser sinensis)是鲟属鱼类中个体最大，生活纬度最南的江海洄游性鱼类，由于过度捕捞、筑坝、航运和污染等人为活动导致中华鲟数量急剧减少，已濒临灭绝。此外，由于其体型巨大，生长缓慢，性成熟周期长等生物学特性导致其种群难以恢复。目前对中华鲟的研究主要集中在形态学、资源生态学和生殖生物学等方面，而在细胞生物学方面研究较少。建立中华鲟组织细胞系有两个重要原因：第一，在细胞水平上保护中华鲟种质资源，第二，中华鲟组织细胞系可作为体外研究模型，支持中华鲟细胞遗传学和生物学等方面的研究。本研究建立了青鱼(Mylopharyngodon piceus)鳍条及中华鲟精巢、肌肉、皮肤、肝脏、鳍条5种组织细胞系，分别命名为MPF、AST、ASM、ASSK、ASL和ASF。目前，MPF传至81代，5种中华鲟组织细胞系均传代到60代，6种细胞的适宜生长温度为28℃，均生长在含有10%FBS、10ng/mLβ-FGF、鱼血清和鱼类胚胎提取液的DMEM全培养基中，生长状态良好，MPF的细胞类型为上皮样细胞，中华鲟细胞类型主要为成纤维样细胞和上皮样细胞。染色体分析结果显示青鱼MPF染色体众数为48，属于正常的二倍体细胞；中华鲟细胞染色体众数为264，为多倍体细胞。MPF细胞系的线粒体16srRNA序列分析结果与NCBI中青鱼的16srRNA序列相似度高于99%。中华鲟细胞系的18srRNA序列分析结果与NCBI中中华鲟的18srRNA序列相似度也均高于99%，这些结果证明了细胞系的来源；通过脂质体转染法、杆状病毒转导法和电穿孔法测试了MPF、AST和ASM3种细胞的转染效率：MPF的脂质体转染法和电穿孔法的瞬时转染效率分别为8%和24%；脂质体转染法和杆状病毒转导法对中华鲟细胞无效而电穿孔法有效，击穿电压200V并且击穿时间10ms时，对中华鲟细胞损伤最小且瞬时转染效率为15%。另外，利用睡美人转座子系统成功构建了转基因AST和ASM细胞系。对青鱼细胞系MPF，进行了基因表达检测和病毒敏感性分析，结果显示，在MPF细胞中存在干细胞标记因子nanog和oct4的表达，说明MPF可能为青鱼鳍条成体干细胞系；MPF细胞对鲤春病毒血症病毒(SVCV)病毒敏感，能产生病变效应，且SVCV可在MPF细胞中大量增殖。青鱼鳍条细胞系的建立不仅可作为研究青鱼基因功能和病毒致病机制的体外工具，为大型淡水鱼类的研究提供理想的体外模型，或许还可以为鱼类干细胞相关基因的功能研究提供材料。通过建立中华鲟细胞系，在细胞水平上保护了珍稀物种中华鲟的种质资源，通过筛选出中华鲟细胞最优的外源基因导入方法，使中华鲟细胞成为研究中华鲟基因功能的理想体外模型。
生殖细胞的发育是生物生长发育、繁殖延续的一个重要且复杂的过程，对生殖细胞增殖分化的分子学机理的研究一直是生命科学的重要课题。Dazl是DAZ家族的重要成员，是生殖细胞的重要标记基因，其在大部分脊椎动物的两性生殖细胞中特异表达，其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞的发育和分化过程中发挥着重要作用。青鱼是我国传统的“四大家鱼”之一，其体型大、生长快、口感好且营养价值高，是我国重要的人工养殖品种，但青鱼性成熟周期长，且人工繁殖难度较高。因此对青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定，为研究青鱼生殖细胞的发育和性腺分化提供重要的工具和参考。本研究通过RACE技术在青鱼中克隆了dazlcDNA，序列全长2013bp，编码216个氨基酸。蛋白序列比对结果显示，其含有RRM(RNA recognition motif)保守区域和一个DAZ重复序列，青鱼Dazl与斑马鱼(Danio rerio)的Dazl序列相似度最高，为85%。通过构建青鱼Dazl重组表达载体诱导Dazl蛋白并制备了兔抗Dazl多克隆抗体，经过验证Dazl抗体可以特异性的识别青鱼Dazl原核表达蛋白、卵巢组织内源蛋白和真核表达蛋白。在组织中，dazl只在青鱼的性腺中表达，组织原位杂交和免疫荧光结果均表明dazl在青鱼的早期卵母细胞中表达，主要分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期卵母细胞的细胞质中。在胚胎发育过程中，dazl在早期胚胎中表达量较高，随着胚胎的发育表达量逐渐降低，到原肠期几乎检测不到表达。整胚原位杂交结果显示dazl在早期胚胎的各个细胞中均表达。通过Tail-PCR技术扩增出1612bp的青鱼dazl基因5’侧翼区启动子序列，并构建启动子不同区段的荧光素酶报告系统psi-CHECK-1612、psi-CHECK-938和psi-CHECK-303。将它们分别转染到SG3、CIK和SKOV3细胞，利用双荧光素酶报告系统鉴定了青鱼dazl基因核心启动子区域，结果表明-850~+88区域存在青鱼dazl基因的重要调控元件。由于青鱼生殖周期较长，且胚胎卵膜薄，不适合进行基因功能研究，因此我们选取模式生物青鳉(Oryzias latipes)作为替代对象，利用CRISPR/Cas9系统对青鳉dazl基因进行敲除，结果表明青鳉dazl的缺失可能会导致青鳉胚胎中原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)的缺失，在F0代成鱼中发现3尾雌性性腺缺失，结果表明dazl可能参与性腺的形成和发育。本研究中通过分析青鱼dazl基因的表达模式，表明青鱼dazl是与生殖细胞形成和发育相关的重要因子，结合dazl在其他鱼类中的表达及青鳉dazl的敲除结果，为后期青鱼dazl基因功能及其生殖细胞的研究提供参考。
综上所述，第一，本研究建立了珍稀濒危物种中华鲟不同组织的细胞系，并对其基本生物学特性进行分析，发现最适于中华鲟细胞的转染方法，建立转基因中华鲟细胞系，在细胞水平上保护了中华鲟的种质资源，并为中华鲟基因功能的研究提供了理想的体外工具。第二，本研究建立青鱼鳍条组织细胞系，对其生物学特性进行了分析，为将来在青鱼细胞系上开展基因功能和病毒致病机制研究奠定了基础。第三，本研究克隆和鉴定了青鱼生殖细胞标记基因dazl，其在胚胎发育的早期和性腺的生殖细胞中表达，另外，青鳉dazl基因的缺失会导致PGCs的缺失，表明其可能在生殖细胞的形成和发育过程中起到关键作用。
生殖细胞的发育是生物生长发育、繁殖延续的一个重要且复杂的过程，对生殖细胞增殖分化的分子学机理的研究一直是生命科学的重要课题。Dazl是DAZ家族的重要成员，是生殖细胞的重要标记基因，其在大部分脊椎动物的两性生殖细胞中特异表达，其编码的RNA结合蛋白在生殖细胞的发育和分化过程中发挥着重要作用。青鱼是我国传统的“四大家鱼”之一，其体型大、生长快、口感好且营养价值高，是我国重要的人工养殖品种，但青鱼性成熟周期长，且人工繁殖难度较高。因此对青鱼生殖细胞标记基因dazl的鉴定，为研究青鱼生殖细胞的发育和性腺分化提供重要的工具和参考。本研究通过RACE技术在青鱼中克隆了dazlcDNA，序列全长2013bp，编码216个氨基酸。蛋白序列比对结果显示，其含有RRM(RNA recognition motif)保守区域和一个DAZ重复序列，青鱼Dazl与斑马鱼(Danio rerio)的Dazl序列相似度最高，为85%。通过构建青鱼Dazl重组表达载体诱导Dazl蛋白并制备了兔抗Dazl多克隆抗体，经过验证Dazl抗体可以特异性的识别青鱼Dazl原核表达蛋白、卵巢组织内源蛋白和真核表达蛋白。在组织中，dazl只在青鱼的性腺中表达，组织原位杂交和免疫荧光结果均表明dazl在青鱼的早期卵母细胞中表达，主要分布在Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ期卵母细胞的细胞质中。在胚胎发育过程中，dazl在早期胚胎中表达量较高，随着胚胎的发育表达量逐渐降低，到原肠期几乎检测不到表达。整胚原位杂交结果显示dazl在早期胚胎的各个细胞中均表达。通过Tail-PCR技术扩增出1612bp的青鱼dazl基因5’侧翼区启动子序列，并构建启动子不同区段的荧光素酶报告系统psi-CHECK-1612、psi-CHECK-938和psi-CHECK-303。将它们分别转染到SG3、CIK和SKOV3细胞，利用双荧光素酶报告系统鉴定了青鱼dazl基因核心启动子区域，结果表明-850~+88区域存在青鱼dazl基因的重要调控元件。由于青鱼生殖周期较长，且胚胎卵膜薄，不适合进行基因功能研究，因此我们选取模式生物青鳉(Oryzias latipes)作为替代对象，利用CRISPR/Cas9系统对青鳉dazl基因进行敲除，结果表明青鳉dazl的缺失可能会导致青鳉胚胎中原始生殖细胞(Primordial germ cells, PGCs)的缺失，在F0代成鱼中发现3尾雌性性腺缺失，结果表明dazl可能参与性腺的形成和发育。本研究中通过分析青鱼dazl基因的表达模式，表明青鱼dazl是与生殖细胞形成和发育相关的重要因子，结合dazl在其他鱼类中的表达及青鳉dazl的敲除结果，为后期青鱼dazl基因功能及其生殖细胞的研究提供参考。
综上所述，第一，本研究建立了珍稀濒危物种中华鲟不同组织的细胞系，并对其基本生物学特性进行分析，发现最适于中华鲟细胞的转染方法，建立转基因中华鲟细胞系，在细胞水平上保护了中华鲟的种质资源，并为中华鲟基因功能的研究提供了理想的体外工具。第二，本研究建立青鱼鳍条组织细胞系，对其生物学特性进行了分析，为将来在青鱼细胞系上开展基因功能和病毒致病机制研究奠定了基础。第三，本研究克隆和鉴定了青鱼生殖细胞标记基因dazl，其在胚胎发育的早期和性腺的生殖细胞中表达，另外，青鳉dazl基因的缺失会导致PGCs的缺失，表明其可能在生殖细胞的形成和发育过程中起到关键作用。