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内生真菌在植物抗生物和非生物胁迫中发挥着重要的作用，目前国内外对内生真菌的多样性、生态分布以及生态功能等方面的研究较多，而对内生真菌在植物中侵染定殖规律的报道较少。本研究以前期筛选的枸杞高活性拮抗内生真菌Fusar&m nematophilum NQ8GⅡ4为材料，通过单因素试验和响应面法优化NQSGⅡ4菌株原生质体制备条件;利用PEG介导原生质体转化法，构建GFP标记的NQ8GⅡ4菌株遗传转化体系;通过表型、拮抗活性、致病性、荧光强度以及PCR检测，筛选与野生型相当的转化子:在此基础上，利用GFP标记的NQ8GⅡ4转化子发酵液灌根处理枸杞植株，明确NQ8GⅡ4菌株在枸杞中的定殖情况及对枸杞促生抗病的影响。研究结果如下:
1、通过单因素试验考察菌龄(12～20h)、酶解时间(0.5～3h)、酶质量浓度(15～35g/L崩溃酶+10g/L溶壁酶)、稳渗剂浓度(O.6～1.2mol/LNaCl)等4个因素对NQ8GⅡ4菌株原生质体产量、再生率和有效原生质体量的影响。采用3因素3水平的Box-Behnken响应面试验优化原生质体制备和再生条件。结果表明，确定酶解时间，酶质量浓度，稳渗剂浓度3因素对原生质体产量、原生质体再生率和有效原生质体量的组合效应。NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件为:过滤收集菌龄16h的菌丝0.05g于1mL质量浓度为30.30g/L崩溃酶+10g/L溶壁酶的酶解液中反应2.5h;以0.713mol/L NaCl为稳渗剂，原生质体产量平均为7.12×107个/mL，再生率平均为5.56％，有效原生质体量平均为39.59×105个/mL，与模型预测值拟合较好。
2、筛选适合枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体。采用PEG介导原生质体转化法分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT年DKNTG转入NQ8GⅡ4菌株。通过对比4种NQ8GⅡ4转化子的荧光强度、遗传稳定性、拮抗活性和致病性，筛选NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的最佳表达载体。枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株对潮霉素B(HmB)的耐受浓度为20mg/L，对遗传霉素(G418)的耐受浓度为80mg/L。通过PEG介导原生质体转化，获得pFL2转化子272株，pDL2转化子57株，r-KNT转化子73株和KNTG转化子226株，转化效率分别为13.6，2.85，3.65和11.3株/μg。荧光显微观察发现，表达载体pDL2和KNTG的转化子所产生的荧光强度明显强于表达载体r-KNT和pFL2的转化子。转化子连续培养5代，pDL2转化子有89.47％可以稳定遗传，pFL2、r-KNT和KNTG转化子的遗传稳定率仅为67.28％，68.49％;和58.85％。4种转化子对枸杞胶孢炭疽菌C.gloeosporioides的拮抗活性以及对枸杞叶片的致病性与野生型无明显差异。表达载体pDL2更适合NQ8GⅡ4菌株的GFP标记。
3、通过酶解NQ8GⅡ4菌株幼嫩菌丝的细胞壁产生原生质体，PEG8000介导外源DNA随机插入的办法，获得转化子。对pDL2转化子菌落形态、产孢量、生长速率、荧光产生情况、遗传稳定性、拮抗性、致病性、活性氧耐受性进行分析，筛选出与野生型无差异的转化子。结果表明:通过PEG介导原生质体转化获得了57株pDL2转化子，转化效率为2.85个/μg。通过测定生长速率和产孢量，筛选出12株与野生型无差异的菌株。通过荧光观察平HPCR检测说明gfp基因已经成功整合到NQ8GⅡ4菌株基因组中，且具有良好的遗传稳定性。通过菌落形态观察和荧光显微观察，转化子的菌落形态、菌丝、孢子、产孢器等与野生型无差异，且所有转化子均可产生绿色荧光，但是荧光强度有差异。通过对枸杞炭疽病菌的拮抗性试验，筛选出l株与野生型无明显差异的菌株NQ-D-47。经过致病性和活性氧平板测定，与野生型无差异。
4、为了研究枸杞内生真菌NQSGⅡ4菌株在枸杞中的定殖情况及对枸杞促生抗病的影响。本研究利用GFP标记的NQ8GⅡ4菌株(NQ-D-47)为材料，对枸杞植株进行灌根处理，在荧光显微镜下观察NQ-D-47菌株在枸杞中的定殖情况，同时检测了不同处理浓度灌根对枸杞植株生长指标和抗病性的影响。结果表明:NQ-D-47菌株能够在枸杞根部定殖，使用10％发酵液进行灌根处理，定殖率达到最大，为93.95％。5％～20％的NQ-D-47菌株发酵液均能促进枸杞植株的生长和根的发育。其中使用5％发酵液灌根，对株高和茎叶重的促进作用最大，相对于对照分别增加了79.68％和100％;使用10％发酵液灌根，对根重和干物质积累量的促进作用最大，相对于对照分别增加了195.56％和85.19％。菌株NQ-D-47在枸杞根部的定殖能诱导枸杞植株中PPO、PAL、POD、SOD4种防御酶活性的提高，提高了枸杞对枸杞炭疽病的抗性。使用10％发酵液进行灌根能够显著的提高枸杞中POD、PAL、PPO、SOD4种防御酶的活性，增强枸杞对枸杞炭疽病的抗性，枸杞发病率仅为6.7％，明显低于未经NQ-D-47灌根处理的枸杞炭疽病菌的发病率(100％)，防效高达93.33％。
1、通过单因素试验考察菌龄(12～20h)、酶解时间(0.5～3h)、酶质量浓度(15～35g/L崩溃酶+10g/L溶壁酶)、稳渗剂浓度(O.6～1.2mol/LNaCl)等4个因素对NQ8GⅡ4菌株原生质体产量、再生率和有效原生质体量的影响。采用3因素3水平的Box-Behnken响应面试验优化原生质体制备和再生条件。结果表明，确定酶解时间，酶质量浓度，稳渗剂浓度3因素对原生质体产量、原生质体再生率和有效原生质体量的组合效应。NQ8GⅡ4菌株原生质体制备的最佳条件为:过滤收集菌龄16h的菌丝0.05g于1mL质量浓度为30.30g/L崩溃酶+10g/L溶壁酶的酶解液中反应2.5h;以0.713mol/L NaCl为稳渗剂，原生质体产量平均为7.12×107个/mL，再生率平均为5.56％，有效原生质体量平均为39.59×105个/mL，与模型预测值拟合较好。
2、筛选适合枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的表达载体。采用PEG介导原生质体转化法分别将GFP标签蛋白表达载体pFL2、pDL2、r-KNT年DKNTG转入NQ8GⅡ4菌株。通过对比4种NQ8GⅡ4转化子的荧光强度、遗传稳定性、拮抗活性和致病性，筛选NQ8GⅡ4菌株GFP标签蛋白的最佳表达载体。枸杞内生真菌NQ8GⅡ4菌株对潮霉素B(HmB)的耐受浓度为20mg/L，对遗传霉素(G418)的耐受浓度为80mg/L。通过PEG介导原生质体转化，获得pFL2转化子272株，pDL2转化子57株，r-KNT转化子73株和KNTG转化子226株，转化效率分别为13.6，2.85，3.65和11.3株/μg。荧光显微观察发现，表达载体pDL2和KNTG的转化子所产生的荧光强度明显强于表达载体r-KNT和pFL2的转化子。转化子连续培养5代，pDL2转化子有89.47％可以稳定遗传，pFL2、r-KNT和KNTG转化子的遗传稳定率仅为67.28％，68.49％;和58.85％。4种转化子对枸杞胶孢炭疽菌C.gloeosporioides的拮抗活性以及对枸杞叶片的致病性与野生型无明显差异。表达载体pDL2更适合NQ8GⅡ4菌株的GFP标记。
3、通过酶解NQ8GⅡ4菌株幼嫩菌丝的细胞壁产生原生质体，PEG8000介导外源DNA随机插入的办法，获得转化子。对pDL2转化子菌落形态、产孢量、生长速率、荧光产生情况、遗传稳定性、拮抗性、致病性、活性氧耐受性进行分析，筛选出与野生型无差异的转化子。结果表明:通过PEG介导原生质体转化获得了57株pDL2转化子，转化效率为2.85个/μg。通过测定生长速率和产孢量，筛选出12株与野生型无差异的菌株。通过荧光观察平HPCR检测说明gfp基因已经成功整合到NQ8GⅡ4菌株基因组中，且具有良好的遗传稳定性。通过菌落形态观察和荧光显微观察，转化子的菌落形态、菌丝、孢子、产孢器等与野生型无差异，且所有转化子均可产生绿色荧光，但是荧光强度有差异。通过对枸杞炭疽病菌的拮抗性试验，筛选出l株与野生型无明显差异的菌株NQ-D-47。经过致病性和活性氧平板测定，与野生型无差异。
4、为了研究枸杞内生真菌NQSGⅡ4菌株在枸杞中的定殖情况及对枸杞促生抗病的影响。本研究利用GFP标记的NQ8GⅡ4菌株(NQ-D-47)为材料，对枸杞植株进行灌根处理，在荧光显微镜下观察NQ-D-47菌株在枸杞中的定殖情况，同时检测了不同处理浓度灌根对枸杞植株生长指标和抗病性的影响。结果表明:NQ-D-47菌株能够在枸杞根部定殖，使用10％发酵液进行灌根处理，定殖率达到最大，为93.95％。5％～20％的NQ-D-47菌株发酵液均能促进枸杞植株的生长和根的发育。其中使用5％发酵液灌根，对株高和茎叶重的促进作用最大，相对于对照分别增加了79.68％和100％;使用10％发酵液灌根，对根重和干物质积累量的促进作用最大，相对于对照分别增加了195.56％和85.19％。菌株NQ-D-47在枸杞根部的定殖能诱导枸杞植株中PPO、PAL、POD、SOD4种防御酶活性的提高，提高了枸杞对枸杞炭疽病的抗性。使用10％发酵液进行灌根能够显著的提高枸杞中POD、PAL、PPO、SOD4种防御酶的活性，增强枸杞对枸杞炭疽病的抗性，枸杞发病率仅为6.7％，明显低于未经NQ-D-47灌根处理的枸杞炭疽病菌的发病率(100％)，防效高达93.33％。