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小麦叶锈病是由小麦柄锈菌(Puccinia tritictna Eriks.)引起的一种气传性真菌病害，在世界范围普遍发生，严重发生可以造成15％～40％的产量损失。我国小麦叶锈病近年呈上升趋势，成为影响小麦生产的重要病害之一。应用抗病品种是防治该病害最经济、安全、高效的方法，但由于小麦叶锈病菌频繁变异，导致小麦抗叶锈基因不断丧失抗叶锈性。研究小麦叶锈病菌致病的分子机制对于了解叶锈菌的与抗病基因的协同进化，合理布局抗病基因，培育持久抗病品具有重要意义。为揭示小麦叶锈病菌致病的分子机制，本论文利用生物信息学手段、异源表达、细菌Ⅲ型分泌系统，HIGS，Real-timePCR、Y2H等技术，系统分析20个候选效应蛋白(effector candidates)对BAX引起坏死的抑制作用，对效应蛋白Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863开展了定量表达分析，鉴定了其毒性功能结构域，分析了其作用位点，初步解析了他们的毒性和无毒性功能。主要研究结果如下:
1.明确了20个候选效应蛋白的序列特征
从前期获得的635个候选效应蛋白中选取20个小分子量并且含有半胱氨酸的候选效应蛋白，进行克隆，通过数据库对候选效应蛋白结构特征的分析发现，20个效应蛋白均为假定蛋白。利用Pfam软件对20个效应蛋白进行分析，发现20个效应蛋白都不存在任何己知的Pfam motif;用MEME5.1.0对效应蛋白进行预测，结果19个候选效应蛋白没有己知结构域(domain)，1个候选效应蛋白Pt1030含有1个已知结构域HARBll_dom，而该结构域存在IPR001584相关蛋白质中，可能是DDE超家族的内切核酸酶。分泌蛋白一级结构分析发现，其余均含半胱氨酸，其中Pt16411的202个氨基酸中含有18个半胱氨酸。
2.利用异源表达明确了效应蛋白具有毒性作用
通过烟草的异源表达系统检测20个候选效应蛋白与BAX/INF1共同注射烟草的效应，结果测试的20个候选效应蛋白均能有效抑制BAX和INF1诱导的坏死反应，确认该20个候选效应蛋白在小麦叶锈病菌中具有毒性作用。
3.效应蛋白能激发一些抗病基因抗病性的表达
将20个效应蛋白利用瞬时表达系统在以Thatcher为背景的全套近等基因系上对20个效应蛋白进行无毒性功能分析，发现Pt13024在近等基因系TcLr30-L出现了坏死反应，Pt18906在近等基因系TcLr27+31上出现了坏死反应，Pt20911在近等摹因系TcLr38上出现了坏死反应，Pt3863在近等基因系TcLr10-上出现了坏死反应。
4.效应蛋白Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863的基本特性
利用营养缺陷型的酵母对效应蛋白Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863的信号肽进行分泌功能的验证，发现Pt13024、Pt20911和Pt3863信号肽具有分泌功能，Pt18906信号肽不具分泌功能。利用qRT-PCR检测效应蛋白基因在小麦叶锈病菌生理小种13-5-72侵染Thatcher叶片0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h、6d、9d和12d后的表达量，发现4个基因均在24h表达量达到了最高峰，而接科-后24h是小麦叶锈病菌产生吸器母细胞和形成吸器的阶段，也是病原与寄主作用激烈的阶段，因此猜测这4个基因可能与叶锈菌致病性有关。对4个效应蛋白进行种内9个叶锈菌株序列多态性分析，发现Pt13024存在2个序列多态性;Pt18906存在3个序列多态性;Pt20911存在2个序列多态性;Pt3863序列比较保守。对Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863共4个效应蛋白进行亚细胞定位，发现4融合表达蛋白均定位于烟草细胞内，表明效应蛋白在寄主细胞内发挥作用。对效应蛋白进行缺失突变体分析，发现Pt13024毒性功能域位于N-末端22-41位氨基酸，;Pt18906毒性功能域位于N-末端28-47位氨基酸;Pt20911毒性功能域位于N-末端19.38位氨基酸;Pt3863毒性功能域位于N-末端20-39位氨基酸。
5.效应蛋白激发寄主的双层防御反应
利用细菌TTSS(TypeⅢsecretion system)介导的瞬时转化在TcLr30表达效应蛋白Pt13024、在TcLr27+31中表达效应蛋白Pt18906、在TcLr38中表达效应蛋白Pt20911、在TcLr10中表达效应蛋白Pt3863，发现4个效应蛋白在各自接种的寄主上均能够激发寄主胼胝质的积累以及活性氧的迸发，胼胝质的积累随着注射时间的增加而逐渐增多;活性氧在短时间内迸发，在注射后10min活性氧的量达到最高。
6.利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)分析效应蛋白的功能
利用HIGS在近等基因系TcLr30、TcLr27+31、TcLr38及TcLr10中分别沉默效应蛋白Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863，利用qPCR技术检测沉默效率，发现4个效应蛋白的表达量相比对照组均明显下降，并且小麦叶锈病菌THSN分别成功侵染了TcLr30、TcLr27+31、TcLr38和TcLr10。表明这些效应蛋白在小麦叶锈病菌侵染寄主过程中被相应的抗病蛋白识别，激发了其相应的抗病反应，抑制了病菌吸器的形成，Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863分别对Lr30、Lr27+31、Lr38、Lr10起无毒性作用。
本研究证实了小麦叶锈病菌效应蛋门序列的多样性和缺乏保守域的特点，效应蛋白在植物细胞内调控植物的防卫反应从而表现其毒性功能或无毒性功能。初步鉴定了Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863分别是往小麦叶锈病菌侵染TCLr30、TcLr27+31、TcLr38和TcLr10过程中发挥无毒性作用的效应蛋白，是Lr30、Lr27+31、Lr38、Lr10的候选无毒基因，试验结果为研究小麦叶锈病菌致病机理研究奠定了基础。
1.明确了20个候选效应蛋白的序列特征
从前期获得的635个候选效应蛋白中选取20个小分子量并且含有半胱氨酸的候选效应蛋白，进行克隆，通过数据库对候选效应蛋白结构特征的分析发现，20个效应蛋白均为假定蛋白。利用Pfam软件对20个效应蛋白进行分析，发现20个效应蛋白都不存在任何己知的Pfam motif;用MEME5.1.0对效应蛋白进行预测，结果19个候选效应蛋白没有己知结构域(domain)，1个候选效应蛋白Pt1030含有1个已知结构域HARBll_dom，而该结构域存在IPR001584相关蛋白质中，可能是DDE超家族的内切核酸酶。分泌蛋白一级结构分析发现，其余均含半胱氨酸，其中Pt16411的202个氨基酸中含有18个半胱氨酸。
2.利用异源表达明确了效应蛋白具有毒性作用
通过烟草的异源表达系统检测20个候选效应蛋白与BAX/INF1共同注射烟草的效应，结果测试的20个候选效应蛋白均能有效抑制BAX和INF1诱导的坏死反应，确认该20个候选效应蛋白在小麦叶锈病菌中具有毒性作用。
3.效应蛋白能激发一些抗病基因抗病性的表达
将20个效应蛋白利用瞬时表达系统在以Thatcher为背景的全套近等基因系上对20个效应蛋白进行无毒性功能分析，发现Pt13024在近等基因系TcLr30-L出现了坏死反应，Pt18906在近等基因系TcLr27+31上出现了坏死反应，Pt20911在近等摹因系TcLr38上出现了坏死反应，Pt3863在近等基因系TcLr10-上出现了坏死反应。
4.效应蛋白Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863的基本特性
利用营养缺陷型的酵母对效应蛋白Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863的信号肽进行分泌功能的验证，发现Pt13024、Pt20911和Pt3863信号肽具有分泌功能，Pt18906信号肽不具分泌功能。利用qRT-PCR检测效应蛋白基因在小麦叶锈病菌生理小种13-5-72侵染Thatcher叶片0h、6h、12h、18h、24h、36h、48h、72h、96h、6d、9d和12d后的表达量，发现4个基因均在24h表达量达到了最高峰，而接科-后24h是小麦叶锈病菌产生吸器母细胞和形成吸器的阶段，也是病原与寄主作用激烈的阶段，因此猜测这4个基因可能与叶锈菌致病性有关。对4个效应蛋白进行种内9个叶锈菌株序列多态性分析，发现Pt13024存在2个序列多态性;Pt18906存在3个序列多态性;Pt20911存在2个序列多态性;Pt3863序列比较保守。对Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863共4个效应蛋白进行亚细胞定位，发现4融合表达蛋白均定位于烟草细胞内，表明效应蛋白在寄主细胞内发挥作用。对效应蛋白进行缺失突变体分析，发现Pt13024毒性功能域位于N-末端22-41位氨基酸，;Pt18906毒性功能域位于N-末端28-47位氨基酸;Pt20911毒性功能域位于N-末端19.38位氨基酸;Pt3863毒性功能域位于N-末端20-39位氨基酸。
5.效应蛋白激发寄主的双层防御反应
利用细菌TTSS(TypeⅢsecretion system)介导的瞬时转化在TcLr30表达效应蛋白Pt13024、在TcLr27+31中表达效应蛋白Pt18906、在TcLr38中表达效应蛋白Pt20911、在TcLr10中表达效应蛋白Pt3863，发现4个效应蛋白在各自接种的寄主上均能够激发寄主胼胝质的积累以及活性氧的迸发，胼胝质的积累随着注射时间的增加而逐渐增多;活性氧在短时间内迸发，在注射后10min活性氧的量达到最高。
6.利用寄主诱导的基因沉默技术(HIGS)分析效应蛋白的功能
利用HIGS在近等基因系TcLr30、TcLr27+31、TcLr38及TcLr10中分别沉默效应蛋白Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863，利用qPCR技术检测沉默效率，发现4个效应蛋白的表达量相比对照组均明显下降，并且小麦叶锈病菌THSN分别成功侵染了TcLr30、TcLr27+31、TcLr38和TcLr10。表明这些效应蛋白在小麦叶锈病菌侵染寄主过程中被相应的抗病蛋白识别，激发了其相应的抗病反应，抑制了病菌吸器的形成，Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863分别对Lr30、Lr27+31、Lr38、Lr10起无毒性作用。
本研究证实了小麦叶锈病菌效应蛋门序列的多样性和缺乏保守域的特点，效应蛋白在植物细胞内调控植物的防卫反应从而表现其毒性功能或无毒性功能。初步鉴定了Pt13024、Pt18906、Pt20911和Pt3863分别是往小麦叶锈病菌侵染TCLr30、TcLr27+31、TcLr38和TcLr10过程中发挥无毒性作用的效应蛋白，是Lr30、Lr27+31、Lr38、Lr10的候选无毒基因，试验结果为研究小麦叶锈病菌致病机理研究奠定了基础。