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衰老是生命的自然规律，是指机体各器官的结构和生理功能随着年龄的增长而逐渐衰退的过程。人类平均寿命在近几十年里有了显著的增长，至21世纪全球步入老龄化社会。随着老龄化程度不断加深，与年龄相关的心血管疾病(cardiovascular disease, CVD)的发病率、患病率及死亡率也逐年上升。高血压和动脉硬化常常引起心、脑、肾等重要靶器官的损害，严重威胁着人们的健康，同时也给国家带来了沉重的经济及社会负担。
高血压是一种老年性疾病，是导致心脑血管疾病的主要危险因素，是全球范围内的重大公共卫生问题。大动脉病变是近年来老年高血压研究的热点之一。动脉硬化不仅是衰老过程的一个重要标志，也是高血压大动脉病变的主要特征。在血管老化进程中，动脉血管壁自身的动态平衡被打破，主要表现在弹力纤维不断减少，胶原纤维不断沉积，引起血管重构，管壁僵硬，弹性下降。在机体衰老过程中，高血压和动脉硬化常相伴发生，相互影响。很遗憾的是，目前上市的降压药物主要通过持续降低外周血管阻力而控制血压，在特异性改善血管重构和硬化方面效果甚微。本课题研究试图寻找衰老相关的高血压和动脉硬化可能的发病机制，探索药物治疗新靶点。
Sirtuins(SIRT)家族,是一类NAD+依赖性脱乙酰化酶，包含7种蛋白(SIRT1-SIRT7)，其中针对SIRT1的研究最为深入。SIRT1定位于细胞内，参与众多和衰老有关的细胞生理过程，被称为“抗衰老酶”，且在CVD中发挥重要作用。近年来，SIRT1对血管内皮系统的作用引起国内外研究者的关注，SIRT1通过氧化应激调节、抗炎、抗凋亡等方式延缓内皮细胞老化，改善血管内皮功能。SIRT1具有丰富的生物学特性，是药物设计的热点靶标。
AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase ， AMPK)广泛存在于真核生物中，是一个高度保守的异三聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AMPK被称为“细胞能量监测器”，能感知细胞能量代谢的变化，维持细胞能量供求平衡。AMPK作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程，其活性主要受AMP/ATP比值以及非AMP依赖的调节通路这两种方式调控。研究表明，AMPK参与调节能量代谢、抑制细胞增殖、抗氧化应激等，在改善血管重构、内皮保护等方面有重要意义。
内皮源性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是一氧化氮(NO)的重要合成酶。在内皮细胞内，eNOS以左旋精氨酸为底物促进NO合成，发挥调节血管内皮细胞功能，促进血管扩张的作用，同时可拮抗肾素‐血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)和交感神经等血管收缩机制，对人体血压调节有重要意义。研究发现，eNOS是SIRTl的重要靶蛋白，SIRTl可通过去乙酰化作用增强eNOS的活性，使内皮源性NO合成增加。此外，eNOS亦是AMPK的下游分子，AMPK可通过磷酸化作用增强eNOS活性，调节血管舒张。SIRT1、eNOS和AMPK是否共同参与衰老相关的高血压和动脉硬化发生发展的过程目前尚不清楚。
胞外囊泡(Extracellular vesicles ， EVs)是由机体各种活细胞分泌至胞外的纳米级膜性囊泡的总称，在细胞间信息交换中起重要作用。根据其分子大小与形成机制大致分为外泌体(exosome)、微囊泡(microvesicle，MV)和凋亡小体三种类型。MSCs具有亚全能分化潜能，能够诱导分化成为多种组织细胞，因其具有多向分化潜能、免疫调控和自我更新复制等特点而日益受到科学家的关注。近年来研究发现，MSCs也可通过释放EVs影响受体细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，是一种非常有潜力的治疗工具。目前国内外尚未发现MSCs源性EVs在改善高血压和动脉硬化中的作用、机制和治疗方面的相关报道。
本课题拟选取不同年龄段小鼠为研究对象，分为以下三部分对衰老和高血压及动脉硬化的关系，以及EVs改善衰老相关的高血压及动脉硬化作用与机制进行初步研究。
第一章高血压和动脉硬化的发生与衰老相关
目的：评估衰老与动脉硬化和高血压的关系。通过监测老年小鼠与成年小鼠脉搏波传导速度(pulse wave velocity，PWV)评估血管弹性，证实衰老可引起血管弹性下降，动脉硬化形成。通过监测老年小鼠和成年小鼠外周血压，证实衰老可引起血压升高。
方法：
(1 )将20只雄性小鼠根据年龄分为老年组和成年组，共两组(6月龄，10只；20月龄，10只)。
(2)每周测量小鼠体重、血糖水平，对比动物基线资料水平。
(3)采用无创尾动脉血压检测法分别测量两组小鼠血压水平。
(4)采用超声多普勒法分别测量两组小鼠PWV。
(5)采用超声多普勒法分别评估两组小鼠心功能。
结果：
(1)老年小鼠血压较成年小鼠明显升高
我们采用无创尾动脉血压检测仪定期测量老年与成年组小鼠尾动脉血压。经过为期2周监测，结果显示，老年组小鼠外周血压较成年组明显升高(P＜0.01)。
(2)老年小鼠血管弹性较成年小鼠减退
我们采用超声多普勒法定期监测老年小鼠与成年组小鼠胸主动脉-腹主动脉PWV以评价小鼠大动脉弹性。经过为期2周监测，结果显示，老年组小鼠PWV较成年组明显增快(P＜0.01)。
(3)老年小鼠和成年小鼠心输出量无显著差异
我们采用超声多普勒法测量小鼠升主动脉血流信号，根据公式计算心输出量。结果显示，成年小鼠和老年小鼠心输出量无统计学差异。
结论：高血压和动脉硬化的发生与衰老相关。
第二章间充质干细胞源性胞外囊泡可改善衰老相关的高血压和动脉硬化
目的：探讨EVs对衰老相关的高血压和动脉硬化的调节作用。首先，从功能学方面证实EVs可调节衰老引起的血管顺应性减退和血管内皮功能障碍。然后，从形态学方面证实EVs可显著改善衰老所致的血管壁重构。
方法：
(1)MSCs细胞培养。
(2)通过差速离心法分离EVs,通过色谱法和免疫分选法对EVs进一步提纯。
(3)动物根据年龄随机分组后药物干预：通过鼠尾静脉向Adult-EVs组和Old-EVs组小鼠静脉注射EVs，剂量18?106个/100μL，每周注射1次，共计4周，Adult-ctrl组和Old-ctrl组给予相同体积PSS。
(4)定期每周监测小鼠血压2次，每2周监测PWV1次。
(5)第6周时，在麻醉状态下采用经导管有创血压检测法直接测量主动脉血压，以确认无创尾动脉血压结果。
(6)处死小鼠，分离组织。
(7)采用微血管压力-直径测定仪检测离体主动脉血管顺应性。
(8)采用微血管张力测定仪检测离体肠系膜动脉内皮功能。
(9)采用Verhoeffs弹性纤维染色法检测主动脉中膜弹性纤维的变化。
(10)采用Massonstrichrome染色法检测主动脉管壁胶原纤维的变化。
(11)采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色法检测主动脉壁外膜和中膜胶原纤维的变化。
结果：
(1)EVs可改善衰老相关的动脉硬化程度
药物干预过程中，持续监测小鼠PWV以评价大动脉弹性。经过为期6周的监测，结果显示，Old-EVs组小鼠PWV较Old-ctrl组显著减慢，差异有统计学意义(P＜0.01)，该结果在成年组无相似发现。
(2)EVs可显著降低衰老相关的高血压
药物干预过程中，我们采用无创尾动脉血压检测法持续监测小鼠血压变化。结果显示Old-EVs组小鼠收缩压逐渐下降，在第3周时与Adult-ctrl组收缩压无统计学差异(P＞0.05)。最终，Old-EVs组收缩压较Old-ctrl组明显降低(P＜0.01)，为了进一步验证上述结果，我们通过颈动脉插管的方法检测小鼠有创血压，结果同前一致。
(3)EVs可调节衰老相关的血管顺应性变化
我们采用微血管压力-直径测定仪观察小鼠离体主动脉血管环直径对管腔内压力增加的被动反应。结果显示，Old-EVs组小鼠主动脉顺应性较Old-ctrl组明显改善(P＜0.01)，说明EVs可调节衰老相关的血管硬化。
(4)EVs可调节衰老相关的动脉内皮功能障碍
我们采用微血管张力测定仪检测离体肠系膜动脉分支血管对Ach和SNP的反应,预测其内皮功能的变化。结果显示，Old-EVs组内皮细胞对Ach反应性良好，较Old-ctrl组有统计学差异(P＜0.05)，说明EVs可调节衰老相关的动脉内皮功能障碍。
(5)EVs可缓解衰老相关的主动脉血管壁重构，改善弹性纤维破坏和胶原纤维沉积
Massonstrichrome染色和IHC染色结果显示，与Adult-ctrl组小鼠相比，Old-ctrl组小鼠主动脉壁中胶原沉积量显著增加(P＜0.01)，Verhoeffs弹性纤维染色法结果显示，Old-ctrl组主动脉壁中弹力板的断裂数量较Adult-ctrl组明显增加。经EVs治疗后，Old-EVs组上述预示血管重构的相关指标变化被明显改善(P＜0.05)。提示EVs可通过调控主动脉中胶原纤维和弹性纤维的变化，改善衰老引起的血管重构。
结论：EVs通过改善动脉内皮功能和血管重构，从而调节血管顺应性和血管弹性，发挥改善衰老相关的高血压和动脉硬化的效应。
第三章间充质干细胞源性胞外囊泡改善衰老相关的高血压和动脉硬化的机制
目的：探讨MSCs源性EVs改善衰老相关的高血压和动脉硬化的机制。
方法：
(1)采用IHC染色和免疫印迹法(Western-blotting ,WB)检测主动脉中SIRT1的表达。
(2)采用IHC染色和WB检测主动脉中eNOS的表达。
(3)HAECs培养和收集。
(4)采用WB检测经EVs处理的HAECs中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、eNOS和p-eNOS的表达。
结果：
(1)EVs可显著增加老年小鼠主动脉eNOS蛋白表达
分别采用WB和IHC染色法检测不同年龄组小鼠主动脉eNOS蛋白的表达及其分布，结果提示eNOS主要分布在内皮细胞中，与Adult-ctrl组相比，Old-ctrl组小鼠主动脉中eNOS蛋白表达明显降低，经EVs干预后，Old-EVs组eNOS表达量显著增加(P＜0.01)。
(2)EVs可显著增加老年小鼠主动脉SIRT1蛋白表达
分别采用WB和IHC染色法检测不同年龄组小鼠主动脉SIRT1蛋白的表达及其分布，结果提示SIRT1分布在主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中。与Adult-ctrl组相比，Old-ctrl组小鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中SIRT1蛋白表达量均明显减少。经EVs干预后，上述指标均明显改善，Old-EVs组SIRT1表达量恢复至正常水平,与Old-ctrl组有统计学差异(P＜0.05)。
(3)EVs可增加内皮细胞中SIRT1蛋白表达，上调AMPKα和eNOS活性蛋白表达
采用人主动脉内皮细胞(HAECs )，通过WB方法，进一步检测EVs对HAECs中SIRT1，AMPKα，eNOS以及活性蛋白p-eNOS，p-AMPKα表达的影响。结果显示，EVs可以增加内皮细胞中SIRT1表达量，上调内皮细胞中AMPK?和eNOS活性蛋白表达，以上结果均有统计学意义(P＜0.05)。
结论：EVs通过增加老化血管中SIRT1蛋白表达量，上调AMPKα，eNOS活性蛋白的表达，促进NO合成释放，从而调节内皮功能和血管顺应性，发挥改善衰老相关的动脉硬化和高血压的效应。
高血压是一种老年性疾病，是导致心脑血管疾病的主要危险因素，是全球范围内的重大公共卫生问题。大动脉病变是近年来老年高血压研究的热点之一。动脉硬化不仅是衰老过程的一个重要标志，也是高血压大动脉病变的主要特征。在血管老化进程中，动脉血管壁自身的动态平衡被打破，主要表现在弹力纤维不断减少，胶原纤维不断沉积，引起血管重构，管壁僵硬，弹性下降。在机体衰老过程中，高血压和动脉硬化常相伴发生，相互影响。很遗憾的是，目前上市的降压药物主要通过持续降低外周血管阻力而控制血压，在特异性改善血管重构和硬化方面效果甚微。本课题研究试图寻找衰老相关的高血压和动脉硬化可能的发病机制，探索药物治疗新靶点。
Sirtuins(SIRT)家族,是一类NAD+依赖性脱乙酰化酶，包含7种蛋白(SIRT1-SIRT7)，其中针对SIRT1的研究最为深入。SIRT1定位于细胞内，参与众多和衰老有关的细胞生理过程，被称为“抗衰老酶”，且在CVD中发挥重要作用。近年来，SIRT1对血管内皮系统的作用引起国内外研究者的关注，SIRT1通过氧化应激调节、抗炎、抗凋亡等方式延缓内皮细胞老化，改善血管内皮功能。SIRT1具有丰富的生物学特性，是药物设计的热点靶标。
AMP激活的蛋白激酶(AMP-activated protein kinase ， AMPK)广泛存在于真核生物中，是一个高度保守的异三聚体丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶。AMPK被称为“细胞能量监测器”，能感知细胞能量代谢的变化，维持细胞能量供求平衡。AMPK作为一种重要的蛋白激酶参与多种代谢过程，其活性主要受AMP/ATP比值以及非AMP依赖的调节通路这两种方式调控。研究表明，AMPK参与调节能量代谢、抑制细胞增殖、抗氧化应激等，在改善血管重构、内皮保护等方面有重要意义。
内皮源性一氧化氮合酶(endothelial nitric oxide synthase，eNOS)是一氧化氮(NO)的重要合成酶。在内皮细胞内，eNOS以左旋精氨酸为底物促进NO合成，发挥调节血管内皮细胞功能，促进血管扩张的作用，同时可拮抗肾素‐血管紧张素系统(renin-angiotensin system, RAS)和交感神经等血管收缩机制，对人体血压调节有重要意义。研究发现，eNOS是SIRTl的重要靶蛋白，SIRTl可通过去乙酰化作用增强eNOS的活性，使内皮源性NO合成增加。此外，eNOS亦是AMPK的下游分子，AMPK可通过磷酸化作用增强eNOS活性，调节血管舒张。SIRT1、eNOS和AMPK是否共同参与衰老相关的高血压和动脉硬化发生发展的过程目前尚不清楚。
胞外囊泡(Extracellular vesicles ， EVs)是由机体各种活细胞分泌至胞外的纳米级膜性囊泡的总称，在细胞间信息交换中起重要作用。根据其分子大小与形成机制大致分为外泌体(exosome)、微囊泡(microvesicle，MV)和凋亡小体三种类型。MSCs具有亚全能分化潜能，能够诱导分化成为多种组织细胞，因其具有多向分化潜能、免疫调控和自我更新复制等特点而日益受到科学家的关注。近年来研究发现，MSCs也可通过释放EVs影响受体细胞，可作为理想的种子细胞用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复，是一种非常有潜力的治疗工具。目前国内外尚未发现MSCs源性EVs在改善高血压和动脉硬化中的作用、机制和治疗方面的相关报道。
本课题拟选取不同年龄段小鼠为研究对象，分为以下三部分对衰老和高血压及动脉硬化的关系，以及EVs改善衰老相关的高血压及动脉硬化作用与机制进行初步研究。
第一章高血压和动脉硬化的发生与衰老相关
目的：评估衰老与动脉硬化和高血压的关系。通过监测老年小鼠与成年小鼠脉搏波传导速度(pulse wave velocity，PWV)评估血管弹性，证实衰老可引起血管弹性下降，动脉硬化形成。通过监测老年小鼠和成年小鼠外周血压，证实衰老可引起血压升高。
方法：
(1 )将20只雄性小鼠根据年龄分为老年组和成年组，共两组(6月龄，10只；20月龄，10只)。
(2)每周测量小鼠体重、血糖水平，对比动物基线资料水平。
(3)采用无创尾动脉血压检测法分别测量两组小鼠血压水平。
(4)采用超声多普勒法分别测量两组小鼠PWV。
(5)采用超声多普勒法分别评估两组小鼠心功能。
结果：
(1)老年小鼠血压较成年小鼠明显升高
我们采用无创尾动脉血压检测仪定期测量老年与成年组小鼠尾动脉血压。经过为期2周监测，结果显示，老年组小鼠外周血压较成年组明显升高(P＜0.01)。
(2)老年小鼠血管弹性较成年小鼠减退
我们采用超声多普勒法定期监测老年小鼠与成年组小鼠胸主动脉-腹主动脉PWV以评价小鼠大动脉弹性。经过为期2周监测，结果显示，老年组小鼠PWV较成年组明显增快(P＜0.01)。
(3)老年小鼠和成年小鼠心输出量无显著差异
我们采用超声多普勒法测量小鼠升主动脉血流信号，根据公式计算心输出量。结果显示，成年小鼠和老年小鼠心输出量无统计学差异。
结论：高血压和动脉硬化的发生与衰老相关。
第二章间充质干细胞源性胞外囊泡可改善衰老相关的高血压和动脉硬化
目的：探讨EVs对衰老相关的高血压和动脉硬化的调节作用。首先，从功能学方面证实EVs可调节衰老引起的血管顺应性减退和血管内皮功能障碍。然后，从形态学方面证实EVs可显著改善衰老所致的血管壁重构。
方法：
(1)MSCs细胞培养。
(2)通过差速离心法分离EVs,通过色谱法和免疫分选法对EVs进一步提纯。
(3)动物根据年龄随机分组后药物干预：通过鼠尾静脉向Adult-EVs组和Old-EVs组小鼠静脉注射EVs，剂量18?106个/100μL，每周注射1次，共计4周，Adult-ctrl组和Old-ctrl组给予相同体积PSS。
(4)定期每周监测小鼠血压2次，每2周监测PWV1次。
(5)第6周时，在麻醉状态下采用经导管有创血压检测法直接测量主动脉血压，以确认无创尾动脉血压结果。
(6)处死小鼠，分离组织。
(7)采用微血管压力-直径测定仪检测离体主动脉血管顺应性。
(8)采用微血管张力测定仪检测离体肠系膜动脉内皮功能。
(9)采用Verhoeffs弹性纤维染色法检测主动脉中膜弹性纤维的变化。
(10)采用Massonstrichrome染色法检测主动脉管壁胶原纤维的变化。
(11)采用免疫组织化学(immunohistochemistry, IHC)染色法检测主动脉壁外膜和中膜胶原纤维的变化。
结果：
(1)EVs可改善衰老相关的动脉硬化程度
药物干预过程中，持续监测小鼠PWV以评价大动脉弹性。经过为期6周的监测，结果显示，Old-EVs组小鼠PWV较Old-ctrl组显著减慢，差异有统计学意义(P＜0.01)，该结果在成年组无相似发现。
(2)EVs可显著降低衰老相关的高血压
药物干预过程中，我们采用无创尾动脉血压检测法持续监测小鼠血压变化。结果显示Old-EVs组小鼠收缩压逐渐下降，在第3周时与Adult-ctrl组收缩压无统计学差异(P＞0.05)。最终，Old-EVs组收缩压较Old-ctrl组明显降低(P＜0.01)，为了进一步验证上述结果，我们通过颈动脉插管的方法检测小鼠有创血压，结果同前一致。
(3)EVs可调节衰老相关的血管顺应性变化
我们采用微血管压力-直径测定仪观察小鼠离体主动脉血管环直径对管腔内压力增加的被动反应。结果显示，Old-EVs组小鼠主动脉顺应性较Old-ctrl组明显改善(P＜0.01)，说明EVs可调节衰老相关的血管硬化。
(4)EVs可调节衰老相关的动脉内皮功能障碍
我们采用微血管张力测定仪检测离体肠系膜动脉分支血管对Ach和SNP的反应,预测其内皮功能的变化。结果显示，Old-EVs组内皮细胞对Ach反应性良好，较Old-ctrl组有统计学差异(P＜0.05)，说明EVs可调节衰老相关的动脉内皮功能障碍。
(5)EVs可缓解衰老相关的主动脉血管壁重构，改善弹性纤维破坏和胶原纤维沉积
Massonstrichrome染色和IHC染色结果显示，与Adult-ctrl组小鼠相比，Old-ctrl组小鼠主动脉壁中胶原沉积量显著增加(P＜0.01)，Verhoeffs弹性纤维染色法结果显示，Old-ctrl组主动脉壁中弹力板的断裂数量较Adult-ctrl组明显增加。经EVs治疗后，Old-EVs组上述预示血管重构的相关指标变化被明显改善(P＜0.05)。提示EVs可通过调控主动脉中胶原纤维和弹性纤维的变化，改善衰老引起的血管重构。
结论：EVs通过改善动脉内皮功能和血管重构，从而调节血管顺应性和血管弹性，发挥改善衰老相关的高血压和动脉硬化的效应。
第三章间充质干细胞源性胞外囊泡改善衰老相关的高血压和动脉硬化的机制
目的：探讨MSCs源性EVs改善衰老相关的高血压和动脉硬化的机制。
方法：
(1)采用IHC染色和免疫印迹法(Western-blotting ,WB)检测主动脉中SIRT1的表达。
(2)采用IHC染色和WB检测主动脉中eNOS的表达。
(3)HAECs培养和收集。
(4)采用WB检测经EVs处理的HAECs中SIRT1、AMPKα、p-AMPKα、eNOS和p-eNOS的表达。
结果：
(1)EVs可显著增加老年小鼠主动脉eNOS蛋白表达
分别采用WB和IHC染色法检测不同年龄组小鼠主动脉eNOS蛋白的表达及其分布，结果提示eNOS主要分布在内皮细胞中，与Adult-ctrl组相比，Old-ctrl组小鼠主动脉中eNOS蛋白表达明显降低，经EVs干预后，Old-EVs组eNOS表达量显著增加(P＜0.01)。
(2)EVs可显著增加老年小鼠主动脉SIRT1蛋白表达
分别采用WB和IHC染色法检测不同年龄组小鼠主动脉SIRT1蛋白的表达及其分布，结果提示SIRT1分布在主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中。与Adult-ctrl组相比，Old-ctrl组小鼠主动脉内皮细胞和平滑肌细胞中SIRT1蛋白表达量均明显减少。经EVs干预后，上述指标均明显改善，Old-EVs组SIRT1表达量恢复至正常水平,与Old-ctrl组有统计学差异(P＜0.05)。
(3)EVs可增加内皮细胞中SIRT1蛋白表达，上调AMPKα和eNOS活性蛋白表达
采用人主动脉内皮细胞(HAECs )，通过WB方法，进一步检测EVs对HAECs中SIRT1，AMPKα，eNOS以及活性蛋白p-eNOS，p-AMPKα表达的影响。结果显示，EVs可以增加内皮细胞中SIRT1表达量，上调内皮细胞中AMPK?和eNOS活性蛋白表达，以上结果均有统计学意义(P＜0.05)。
结论：EVs通过增加老化血管中SIRT1蛋白表达量，上调AMPKα，eNOS活性蛋白的表达，促进NO合成释放，从而调节内皮功能和血管顺应性，发挥改善衰老相关的动脉硬化和高血压的效应。