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高强度聚焦超声(High intensity focused ultrasound，HIFU)是一种无创性治疗技术，目前广泛应用于多种良、恶性肿瘤的治疗。提高效率及安全性是HIFU发展的迫切要求，引入增效剂是解决这一问题的有效手段。纳米级超声造影剂不仅可以实现超声显像，同时具有很好的HIFU增效作用。但其显影能力不及微米级超声造影剂，靶向性不够全面，不能适应HIFU治疗的普遍需要。
双歧杆菌是人肠道内益生菌，据报道可以在肿瘤乏氧区内定植的特点，具有较广泛的肿瘤靶向性和良好的生物安全性。本课题在体外利用静电作用将长双歧杆菌(BF)和一种纳米超声造影剂-阳离子全氟己烷纳米粒(CPNs)相结合成为一种安全的生物靶向增效剂，观察双歧杆菌是否能促进纳米粒的聚集以及超声显影，进而将BF-CPNs引入体内，利用超声和活体荧光技术观察BF-CPNs能否在肿瘤区聚集和滞留，在体内是否能达到增强聚集和超声显影效果，并利用离体模型和荷瘤鼠模型检验双歧杆菌联合纳米粒对HIFU治疗的增效效果。
目的
验证双歧杆菌肿瘤靶向定植能力。采用体外连接和体内寻靶两种注射方式验证双歧杆菌和阳离子全氟己烷纳米粒体内结合的可行性和稳定性。利用离体牛肝及荷瘤鼠模型，评估阳离子纳米粒与双歧杆菌对HIFU治疗增效作用。
方法
培养长双歧杆菌ATCC15707(BF),观察其性状与检测表征，测定其生长曲线，用局部注射和静脉注射两种方法将双歧杆菌引入荷瘤裸鼠体内，于24h、48h、96h后摘取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾等器官，分别切片革兰染色进行组织学观察以及匀浆培养，检测细菌在肿瘤区不同时间的增殖情况。
制备阳离子全氟己烷纳米粒(CPNs)，观察其性状及表征，检测纳米粒的稳定性，并观察纳米粒在升温作用下的相变过程。
通过在体外使二者混合后以静电作用结合，以不同比例混合寻求最佳结合率；不同比例BF-CPNs混合物置于琼脂体模中用超声探查获得二维超声图像，测量样品图像灰度值；将BF-CPNs同乳腺癌细胞混合培养，观察双歧杆菌及纳米粒对肿瘤细胞的粘附作用。采用连接后局部注射BF-CPNs和先局部注射BF增菌再尾静脉注射CPNs的方式，以乳腺癌荷瘤裸鼠为模型，用活体荧光观察纳米粒在体内的分布。在体外将阳离子全氟己烷纳米粒(CPNs)和长双歧杆菌ATCC15707(BF)通过静电作用以优化的比例结合，利用体外牛肝模型，超声引导下注射BF-CPNs、CPNs及脱气水，即刻HIFU辐照，评价其增效效果。制作裸鼠乳腺癌肿瘤模型，超声引导下进行瘤内注射BF-CPNs、CPNs、BF及脱气水，于0-48h不同时间点用超声观察阳离子纳米粒在各组裸鼠肿瘤区的分布。选择48h时间点进行HIFU消融治疗，同时超声监测系统测定治疗前后灰度变化，治疗后处死裸鼠获取局部组织进行TTC染色，切片进行HE染色及革兰氏染色，对比不同组的坏死情况，评估其增效效果。
结果
双歧杆菌革兰染色阳性，表面电位约-38mv；双歧杆菌培养生长曲线显示4-18h为其对数生长期；采用瘤内注射及静脉注射两种方式将BF引入荷瘤裸鼠体内，细菌在肿瘤区增殖均随时间呈增长趋势，瘤内注射肿瘤内细菌增殖速度更快，局部注射24h在正常组织未查见细菌，静脉注射在正常组织96h后未查见细菌，血液培养24小时后均未检出细菌。
制备的全氟己烷阳离子纳米粒(CPNs)粒径小，表面带正电荷，能在7天内保持稳定，60-70℃升温条件下可产生液气相变。CPNs与BF在体外结合率可接近100%。体积比3∶1结合的BF-CPNs可获得稳定的分散良好的悬液，并在超声探查下获得良好的对比度，灰度值达102±38dB，与脱气水和对照组比较有显著性差异。将BF-CPNs与乳腺癌细胞共同孵育，阳离子纳米粒能促进双歧杆菌粘附于肿瘤细胞。荷瘤鼠瘤内注射BF-CPNs，肿瘤区荧光稳定持续48小时以上，对照组肿瘤区荧光随时间逐渐降低，二者差异显著。先肿瘤内注射双歧杆菌96h后再静脉注射阳离子纳米粒，肿瘤区荧光随时间增高，48h时间点与对照组有显著性差别。
离体牛肝实验中BF-CPNs能在超声监视下定点观察造影剂的进入，辐照前超声灰度变化与对照组和空白组有显著性差异，行牛肝HIFU辐照，即刻灰度变化值，实验组消融体积与对照组无差别(BF-CPNs组118.37±37.3mm3，CPNs组112.9±35.3mm3，P＜0.05)，但明显优于空白组(37.55±17.7mm3，P＞0.05)。超声监导下荷瘤裸鼠肿瘤内注射，BF-CPNs在造影及二维模式下均能获得良好的超声对比，超声影像可持续48h，与对照组比较有显著性差异。注射后48小时对荷瘤鼠进行HIFU消融，消融体积较对照组明显增大(BF-CPNs组84.9±9.4mm3，CPNs组49.3±7.3mm3，P＜0.05)，组织切片显示消融面积扩大，消融区与正常组织分界清晰，热坏死带狭窄，效果优于对照组。
结论
双歧杆菌表面电位为负，在肿瘤区具有靶向增殖特性。采用瘤内注射双歧杆菌可以短时间增加肿瘤区内细菌数量且对正常组织影响小。制备的阳离子全氟己烷纳米粒表面带正电荷，在升温作用下可发生液气相变。BF与CPNs以静电吸附的作用能在体外相结合，体外能在超声探查下显影。双歧杆菌在肿瘤区增殖，能促进阳离子纳米粒在肿瘤区的聚积和滞留。瘤内注射BF-CPNs可以在超声监导下显影，HIFU增效时效长，作用明显。
双歧杆菌是人肠道内益生菌，据报道可以在肿瘤乏氧区内定植的特点，具有较广泛的肿瘤靶向性和良好的生物安全性。本课题在体外利用静电作用将长双歧杆菌(BF)和一种纳米超声造影剂-阳离子全氟己烷纳米粒(CPNs)相结合成为一种安全的生物靶向增效剂，观察双歧杆菌是否能促进纳米粒的聚集以及超声显影，进而将BF-CPNs引入体内，利用超声和活体荧光技术观察BF-CPNs能否在肿瘤区聚集和滞留，在体内是否能达到增强聚集和超声显影效果，并利用离体模型和荷瘤鼠模型检验双歧杆菌联合纳米粒对HIFU治疗的增效效果。
目的
验证双歧杆菌肿瘤靶向定植能力。采用体外连接和体内寻靶两种注射方式验证双歧杆菌和阳离子全氟己烷纳米粒体内结合的可行性和稳定性。利用离体牛肝及荷瘤鼠模型，评估阳离子纳米粒与双歧杆菌对HIFU治疗增效作用。
方法
培养长双歧杆菌ATCC15707(BF),观察其性状与检测表征，测定其生长曲线，用局部注射和静脉注射两种方法将双歧杆菌引入荷瘤裸鼠体内，于24h、48h、96h后摘取肿瘤、心、肝、脾、肺、肾等器官，分别切片革兰染色进行组织学观察以及匀浆培养，检测细菌在肿瘤区不同时间的增殖情况。
制备阳离子全氟己烷纳米粒(CPNs)，观察其性状及表征，检测纳米粒的稳定性，并观察纳米粒在升温作用下的相变过程。
通过在体外使二者混合后以静电作用结合，以不同比例混合寻求最佳结合率；不同比例BF-CPNs混合物置于琼脂体模中用超声探查获得二维超声图像，测量样品图像灰度值；将BF-CPNs同乳腺癌细胞混合培养，观察双歧杆菌及纳米粒对肿瘤细胞的粘附作用。采用连接后局部注射BF-CPNs和先局部注射BF增菌再尾静脉注射CPNs的方式，以乳腺癌荷瘤裸鼠为模型，用活体荧光观察纳米粒在体内的分布。在体外将阳离子全氟己烷纳米粒(CPNs)和长双歧杆菌ATCC15707(BF)通过静电作用以优化的比例结合，利用体外牛肝模型，超声引导下注射BF-CPNs、CPNs及脱气水，即刻HIFU辐照，评价其增效效果。制作裸鼠乳腺癌肿瘤模型，超声引导下进行瘤内注射BF-CPNs、CPNs、BF及脱气水，于0-48h不同时间点用超声观察阳离子纳米粒在各组裸鼠肿瘤区的分布。选择48h时间点进行HIFU消融治疗，同时超声监测系统测定治疗前后灰度变化，治疗后处死裸鼠获取局部组织进行TTC染色，切片进行HE染色及革兰氏染色，对比不同组的坏死情况，评估其增效效果。
结果
双歧杆菌革兰染色阳性，表面电位约-38mv；双歧杆菌培养生长曲线显示4-18h为其对数生长期；采用瘤内注射及静脉注射两种方式将BF引入荷瘤裸鼠体内，细菌在肿瘤区增殖均随时间呈增长趋势，瘤内注射肿瘤内细菌增殖速度更快，局部注射24h在正常组织未查见细菌，静脉注射在正常组织96h后未查见细菌，血液培养24小时后均未检出细菌。
制备的全氟己烷阳离子纳米粒(CPNs)粒径小，表面带正电荷，能在7天内保持稳定，60-70℃升温条件下可产生液气相变。CPNs与BF在体外结合率可接近100%。体积比3∶1结合的BF-CPNs可获得稳定的分散良好的悬液，并在超声探查下获得良好的对比度，灰度值达102±38dB，与脱气水和对照组比较有显著性差异。将BF-CPNs与乳腺癌细胞共同孵育，阳离子纳米粒能促进双歧杆菌粘附于肿瘤细胞。荷瘤鼠瘤内注射BF-CPNs，肿瘤区荧光稳定持续48小时以上，对照组肿瘤区荧光随时间逐渐降低，二者差异显著。先肿瘤内注射双歧杆菌96h后再静脉注射阳离子纳米粒，肿瘤区荧光随时间增高，48h时间点与对照组有显著性差别。
离体牛肝实验中BF-CPNs能在超声监视下定点观察造影剂的进入，辐照前超声灰度变化与对照组和空白组有显著性差异，行牛肝HIFU辐照，即刻灰度变化值，实验组消融体积与对照组无差别(BF-CPNs组118.37±37.3mm3，CPNs组112.9±35.3mm3，P＜0.05)，但明显优于空白组(37.55±17.7mm3，P＞0.05)。超声监导下荷瘤裸鼠肿瘤内注射，BF-CPNs在造影及二维模式下均能获得良好的超声对比，超声影像可持续48h，与对照组比较有显著性差异。注射后48小时对荷瘤鼠进行HIFU消融，消融体积较对照组明显增大(BF-CPNs组84.9±9.4mm3，CPNs组49.3±7.3mm3，P＜0.05)，组织切片显示消融面积扩大，消融区与正常组织分界清晰，热坏死带狭窄，效果优于对照组。
结论
双歧杆菌表面电位为负，在肿瘤区具有靶向增殖特性。采用瘤内注射双歧杆菌可以短时间增加肿瘤区内细菌数量且对正常组织影响小。制备的阳离子全氟己烷纳米粒表面带正电荷，在升温作用下可发生液气相变。BF与CPNs以静电吸附的作用能在体外相结合，体外能在超声探查下显影。双歧杆菌在肿瘤区增殖，能促进阳离子纳米粒在肿瘤区的聚积和滞留。瘤内注射BF-CPNs可以在超声监导下显影，HIFU增效时效长，作用明显。