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肉鸡肺动脉高压综合征(PHS),又称肉鸡腹水综合征,是发生于快速生长的肉鸡的一种营养代谢性疾病。据Maxwell调查,世界肉鸡业因PHS造成的损失每年达10亿美元左右。如何有效防治PHS已是当前急待解决的热点与难点之一。本研究通过对肉鸡翅静脉注射纤维素微粒诱发肺动脉高压,从而引发肉鸡肺动脉高压综合征,通过研究5一羟色胺(5-HT)在肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖和肺血管重构中的作用进一步探讨PHS的发生机制,探索新的防治肉鸡PHS的方法。
实验I静脉注射纤维素微粒致肉鸡肺动脉高压综合征模型的建立。在实验中,对肉鸡翅静脉注射纤维素微粒,记录并对比对照组及诱病组肉鸡的体重、周增重,饲料转化率、PHS发病率、红细胞压积(PCV)、血红蛋白(HB)含量、血清中白蛋白(ALB)、总蛋白(TP)量、右心室重与全心室重量比值(RV/TV),并且进行肺组织形态学观察,计算单位面积肺组织切片内的纤维素微粒个数及炎性细胞浸润灶数。试验结果显示,诱病组肉鸡PHS发病率显著增加,诱病组肉鸡与对照组肉鸡的上市体重、周增重及饲料转化率无显著差异;诱病组肉鸡血清中ALB、TP降低,PCV、HB和RV/TV值升高,另外,肺组织形态学观察发现纤维素微粒阻塞于肺小血管内,引起炎性细胞和血小板的聚集。以上结果表明静脉注射纤维素微粒可成功诱发肉鸡PHS。
实验II纤维素微粒诱发的肺动脉高压综合征肉鸡肺血管平滑肌细胞增殖的研究。对肉鸡翅静脉注射纤维素微粒,采用增殖细胞核抗原(PCNA)免疫组织化学染色法和核仁组织区嗜银蛋白(AgNOR)染色法,观察肉鸡肺血管平滑肌细胞增殖的变化。采用5-HT免疫组织化学染色法观察肺小动脉血管壁5-HT的含量。试验结果表明,静脉注射纤维素微粒可导致肉鸡肺小动脉中膜平滑肌PCNA阳性细胞数量和AgNOR阳性细胞比例显著增加。揭示肺小动脉可能捕获了经由静脉注射的纤维素微粒,从而诱发PHS肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)过度增殖诱病组肉鸡肺小动脉管壁5-HT含量显著高于对照组,相关分析结果表明,肉鸡肺血管壁5-HT含量与PCNA阴性细胞数量和AgNOR阳性细胞比例呈显著正相关,表明肺组织5-HT含量增加在肺血管平滑肌细胞的增殖过程中起到了重要的作用。
实验III纤维素微粒诱发的肺动脉高压综合征肉鸡血管重构指标的研究。对肉鸡翅静脉注射纤维素微粒,采用Weiger套Van-Giesen弹力纤维染色方法对肺组织切片染色,并通过计算机病理图像分析软件测定肉鸡肺小动脉相对中膜面积(WA/TA)、平均中膜厚度(mMTPA)和肺厚壁末梢血管百分比(TWPV%)。结果显示,从28日龄(静注纤维素微粒后第8天)起,诱病组肉鸡WA/TA值、mMTPA值和TWPV%均显著高于对照组(P<0.05)。结果表明,诱病组肉鸡发生了肺小动脉中膜增厚和肺小动脉肌性化的现象,提示PVR的发生。
实验Ⅳ胶原酶消化法培养肉鸡肺动脉平滑肌细胞(PASMC)。采用胶原酶消化法培养原代肉鸡PASMC,通过形态学方法和抗α肌动蛋白抗体免疫组织化学染色法对所培养的细胞进行鉴定。镜下观察细胞形态呈长梭形,放射状生长,细胞成簇,排列紧密。部分区域细胞多层重叠,高低起伏,呈现平滑肌细胞特有的“峰一谷”状。抗α肌动蛋白抗体免疫组织化学法染色可见胞浆内有明显细丝,呈棕黄色,染色阳性率为97%,表明所培养的细胞是肉鸡PASMC。
实验V5一羟色胺对体外培养的肉鸡肺动脉平滑肌细胞增殖、细胞周期和凋亡的影响。对胶原酶消化法培养的原代肉鸡PASMC,使用MTT法检测不同浓度5-HT对离体培养肉鸡PASMC增殖的影响;并且采用流式细胞术和Hoechst33258染色法分析不同浓度5-HT对体外培养的PASMC凋亡和细胞周期的影响。结果表明,10-4~10-7mol/L的5-HT能显著促进肉鸡PASMC的增殖,并呈剂量依赖性。5-HT可引起G1期细胞减少,S期细胞显著增多,正常细胞由G1期向S期转化,并可降低正常细胞的比例,明显促进正常细胞的早期和晚期凋亡。其机理可能是5-HT加速肉鸡PASMC从G1期向S期过渡,促使PASMC的分裂和增殖,其幅度比促进肉鸡PASMC凋亡大,因此在总体上表现为5-HT可促进PASMC的增殖。