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猪圆环病毒2型(PCV2)不仅可引起断奶仔猪多系统衰竭综合征(PMWS)，而且还与猪皮炎与肾病综合征(PDNS)、猪呼吸道疾病综合征(PRDC)、猪先天性振颤、母猪繁殖障碍、猪增生性和坏死性肺炎等疾病密切相关。自从20世纪90年代发现可致猪的疾病以来，PCV2病毒在世界各国迅速蔓延。目前PCV2在猪群中的感染率非常高，造成猪的生长缓慢，饲料报酬下降，同时侵害猪的免疫系统，导致猪的免疫机能下降，造成其它疾病的大暴发，给世界养猪业造成了巨大的经济损失。我国也于2000年检测到了该病毒的存在，该病毒在我国猪群的感染率近乎50％，给我国的养猪业也造成了严重的打击。目前对于该病毒的防制主要是依靠疫苗，而由于该病毒在细胞上增殖滴度很低，发展传统的灭活疫苗和弱毒疫苗非常困难，因此，研制安全、高效、廉价的新型疫苗成为越来越多研究者关注的焦点，但目前对于PCV2的新型疫苗的研究进展一直比较缓慢。本研究对PCV2ORF2主要抗原位点在毕赤酵母中表达进行了新的探索，构建了重组表达质粒pPICZαC-PCV2ORF2—A并在毕赤酵母中实现了分泌表达。主要研究内容如下：
把PCV2 ORF2的三个主要抗原位点通过接头进行串联，在序列的两端加入了EcoRⅠ和KpnⅠ两个酶切位点并在该序列的3’端加入了终止密码子，然后按照酵母密码子的偏爱性人工合成了这段基因。合成的基因与连接载体pMD19-T连接，经转化大肠杆菌，得到阳性克隆JM109/T-PCV2ORF2—A。JM109/T-PCV2ORF2—A与表达载体pPICZαC分别经过EcoRⅠ和KpnⅠ双酶切，然后连接转化大肠杆菌DH5α，得到重组表达质粒pPICZαC-PCV2ORF2—A，送公司测序鉴定。结果显示目的基因完整PCV2ORF2—A已经正确插入表达载体pPICZαC中。
重组表达质粒pPICZαC—经SacⅠ单酶切电泳后，纯化回收，300V、15μs电击转化感受态的毕赤酵母工程菌X—33，涂布YPDS+ZeocinTM选择性培养基，置28℃温箱培养4—5天，结果获得多个单菌落。通过提高抗生素浓度，筛选出具高抗性的转化子。进行诱导表达，每24h添加一次甲醇，保持终浓度为1.0％。诱导表达3天后，收集菌液，离心，取上清。取少量上清液进行SDS-PAGE电泳分析，可见在分子量为6.5KD附近出现了一条的清晰蛋白条带，而空载体转化宿主菌的对照未发现特异的蛋白条带。证明构建的多肽得到了表达，为进一步研究奠定了基础。