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副猪嗜血杆菌是副猪嗜血杆菌病的病原菌，属于巴斯德菌科嗜血杆菌属，由Schermer和Ehrlich在1922年首次分离。副猪嗜血杆菌病在全世界均有发生，近10年来该病在规模化猪场的感染率和死亡率日益增高，已成为危害养猪业较严重的细菌性疾病之一。本研究旨在分离鉴定副猪嗜血杆菌，对aroA基因进行克隆分析及建立与三种DNA病毒的多重PCR。
结果如下：
1.本研究利用添加辅酶Ⅰ和血清的特殊培养基从广东多个猪场中成功分离到5株副猪嗜血杆菌，对其做了卫星生长试验，生化鉴定和PCR检测。卫星生长试验中“卫星”现象明显。生化鉴定试验结果显示：副猪嗜血杆菌培养24～48h后，观察结果可见氧化酶、山梨醇、吲哚实验为阴性，蔗糖、果糖、葡萄糖、木糖、麦芽糖等糖类实验为阳性，接触酶与NAD实验为阳性，尿素酶、甘露醇、棉籽糖等结果不统一。此结果与文献报道的副猪嗜血杆菌生化特性相符。PCR检测成功扩增出821bp大小的目的片段，与预期目的片断一致。
2.对分离到的5株副猪嗜血杆菌，进行基因克隆及序列分析。通过5株菌株间基因序列的比较，发现5株菌株的核苷酸序列同标准菌株的核苷酸序列相似性为96.3％～99.8％，氨基酸序列相似性为98.2％～99.5％；并与其他的革兰氏阴性菌的基因序列进行对比，这五株菌的核苷酸序列同其他革兰氏阴性菌的核苷酸序列的相似性为50.5％～78.5％，氨基酸序列的相似性仅为50.5％～77.5％。表明aroA基因不仅在副猪嗜血杆菌间是高度保守的，而且在巴氏杆菌科的许多成员中也是一个相对保守和遗传稳定的基因。aroA基因在副猪嗜血杆菌中高度的相似性，为以后对其进行基因工程疫苗的研究奠定了基础。
3.在对副猪嗜血杆菌病进行实地观察临床症状、病理剖检、实验室检测时发现猪场爆发病例普遍存在副猪嗜血杆菌、猪圆环病毒、猪蓝耳病毒和猪细小病毒的混合感染。鉴于此，本研究建立了副猪嗜血杆菌、猪伪狂犬病毒、猪细小病毒的三重PCR及猪圆环病毒、猪细小病毒、猪伪狂犬病毒的三重PCR这两组三重PCR的检测方法。分别对三种DNA病毒进行了单项PCR优化及对这两组三重PCR进行了优化，重点从引物浓度、模板浓度、酶加量、退火温度方面进行条件优化。最终确立了两组三重PCR反应条件的最适量，加入的引物量分别为1.5μL，加入的酶的量为0.2μL，加入的Mg2+量为1μL，最终确定的退火温度为57℃。敏感性试验表明，三重PCR最低能检出的HPS的DNA为12pg，PPV的DNA为16pg，PRV的DNA为7.6pg，PCV2的DNA为6.3pg。