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目的：
近年来，冠状动脉粥样硬化性心脏病已成为影响人类健康的主要慢性疾病之一，大量中药复方的临床应用在治疗冠心病方面取得了显著疗效，在此基础上，探究复方中主要药物的有效成分对于研发治疗冠心病的新药具有重要意义。动脉粥样硬化是冠心病的主要病理基础，巨噬细胞泡沫化的形成和凋亡贯穿整个动脉粥样硬化的发展过程中。因此本研究用OX-LDL刺激小鼠Raw264.7细胞建立动脉粥样硬化泡沫细胞模型，选用益气代表药黄芪的有效成分黄芪多糖和逐瘀通络代表药水蛭的有效成分水蛭素进行联合干预，进而从细胞层面揭示黄芪多糖和水蛭素联合干预对OX-LDL诱导巨噬细胞泡沫化脂质积聚和凋亡的作用机制，为开发治疗动脉粥样硬化的临床新药提供科学的实验依据。
方法：
选择小鼠Raw264.7细胞株进行传代培养，100ug/mlOX-LDL刺激Raw264.7细胞24小时建立泡沫细胞模型。通过CCK-8筛选水蛭素和黄芪多糖安全药物浓度，设立水蛭素低中高剂量组分别为10ug/ml、20ug/ml和40ug/ml，黄芪多糖低中高剂量组分别为25ug/ml、50ug/ml和100ug/ml，实验设立空白组、模型组、药物低中高剂量组，分别通过油红O染色和氧化酶法检测OX-LDL诱导巨噬细胞内胆固醇含量，从而确定药物最佳有效浓度。将最佳有效浓度的水蛭素和黄芪多糖进行联合干预，将实验分为空白组、模型组和药物联合干预组，利用流式细胞仪检测OX-LDL诱导巨噬细胞早期、晚期和总凋亡率；用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位的变化；蛋白印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达水平，并进行分析。
结果：
1.CCK-8检测发现，随着水蛭素药物浓度的增加对巨噬细胞生长有显著抑制作用，与正常组细胞相比较，水蛭素药物浓度大于80μg/ml时细胞增长受到抑制，有统计学差异（P＜0.05），故选择10、20、40μg/ml浓度的水蛭素溶液为低、中、高不同的药物剂量组；黄芪多糖药物浓度的增加对巨噬细胞的生长具有增殖作用，结合相关文献我们选择25、50、100μg/ml浓度的黄芪多糖溶液为低、中、高不同的药物剂量组。
2.将Raw264.7细胞与100ug/ml OX-LDL共培养24h之后，OX-LDL能够刺激Raw264.7细胞转化为泡沫细胞，与正常组相比较，模型组细胞内的胆固醇的含量明显增加，有统计学意义（P＜0.05）；药物低中高剂量组分别同模型组相比较发现，水蛭素40ug/ml高剂量组和黄芪多糖100ug/ml高剂量组干预后，胆固醇的含量分别较低中剂量组降低更明显（P＜0.05），胞浆中红色脂滴减少，油红O染色效果更弱。
3.水蛭素40ug/ml和黄芪多糖100ug/ml联合干预组较单独水蛭素40ug/ml剂量组、黄芪多糖100ug/ml剂量组降低胆固醇含量更明显，有统计学意义（P＜0.05)，油红O染色效果较弱。
4.与正常组相比较，模型组能够显著增加OX-LDL诱导的巨噬细胞早期、晚期以及总凋亡率，具有统计学意义（P＜0.01）；水蛭素40μg/ml和黄芪多糖100μg/ml联合干预组与模型组相比较，可以显著降低OX-LDL诱导的巨噬细胞早期凋亡率和总凋亡率，具有统计学意义（P＜0.01)。
5.与正常组相比较，模型组巨噬细胞经OX-LDL刺激后线粒体膜电位下降，具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比较，水蛭素40μg/ml和黄芪多糖100μg/ml联合干预组上调巨噬细胞的线粒体膜电位，具有统计学意义（P＜0.01）。
6.与正常组相比较，模型组细胞内 Caspase3蛋白表达量和Bax蛋白表达量显著上升，Bcl-2蛋白表达量显著下降，有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比较，水蛭素40μg/ml和黄芪多糖100μg/ml药物联合干预后，细胞内 Caspase3和Bax蛋白表达量降低，Bcl-2蛋白表达量升高，具有统计学意义（P＜0.05)。
结论：
1.水蛭素40ug/ml、黄芪多糖100ug/ml和两者联合干预都降低巨噬细胞内的脂质积聚，但水蛭素40ug/ml和黄芪多糖100ug/ml联合干预后疗效优于单独药物作用。
2.水蛭素40ug/ml和黄芪多糖100ug/ml联合干预可降低OX-LDL诱导巨噬细胞凋亡率，其治疗AS作用机制可能与调控线粒体膜电位和相关促凋亡蛋白Caspase3、Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。
近年来，冠状动脉粥样硬化性心脏病已成为影响人类健康的主要慢性疾病之一，大量中药复方的临床应用在治疗冠心病方面取得了显著疗效，在此基础上，探究复方中主要药物的有效成分对于研发治疗冠心病的新药具有重要意义。动脉粥样硬化是冠心病的主要病理基础，巨噬细胞泡沫化的形成和凋亡贯穿整个动脉粥样硬化的发展过程中。因此本研究用OX-LDL刺激小鼠Raw264.7细胞建立动脉粥样硬化泡沫细胞模型，选用益气代表药黄芪的有效成分黄芪多糖和逐瘀通络代表药水蛭的有效成分水蛭素进行联合干预，进而从细胞层面揭示黄芪多糖和水蛭素联合干预对OX-LDL诱导巨噬细胞泡沫化脂质积聚和凋亡的作用机制，为开发治疗动脉粥样硬化的临床新药提供科学的实验依据。
方法：
选择小鼠Raw264.7细胞株进行传代培养，100ug/mlOX-LDL刺激Raw264.7细胞24小时建立泡沫细胞模型。通过CCK-8筛选水蛭素和黄芪多糖安全药物浓度，设立水蛭素低中高剂量组分别为10ug/ml、20ug/ml和40ug/ml，黄芪多糖低中高剂量组分别为25ug/ml、50ug/ml和100ug/ml，实验设立空白组、模型组、药物低中高剂量组，分别通过油红O染色和氧化酶法检测OX-LDL诱导巨噬细胞内胆固醇含量，从而确定药物最佳有效浓度。将最佳有效浓度的水蛭素和黄芪多糖进行联合干预，将实验分为空白组、模型组和药物联合干预组，利用流式细胞仪检测OX-LDL诱导巨噬细胞早期、晚期和总凋亡率；用流式细胞仪和激光共聚焦显微镜检测细胞线粒体膜电位的变化；蛋白印迹法检测抗凋亡蛋白Bcl-2以及促凋亡蛋白Caspase3和Bax的表达水平，并进行分析。
结果：
1.CCK-8检测发现，随着水蛭素药物浓度的增加对巨噬细胞生长有显著抑制作用，与正常组细胞相比较，水蛭素药物浓度大于80μg/ml时细胞增长受到抑制，有统计学差异（P＜0.05），故选择10、20、40μg/ml浓度的水蛭素溶液为低、中、高不同的药物剂量组；黄芪多糖药物浓度的增加对巨噬细胞的生长具有增殖作用，结合相关文献我们选择25、50、100μg/ml浓度的黄芪多糖溶液为低、中、高不同的药物剂量组。
2.将Raw264.7细胞与100ug/ml OX-LDL共培养24h之后，OX-LDL能够刺激Raw264.7细胞转化为泡沫细胞，与正常组相比较，模型组细胞内的胆固醇的含量明显增加，有统计学意义（P＜0.05）；药物低中高剂量组分别同模型组相比较发现，水蛭素40ug/ml高剂量组和黄芪多糖100ug/ml高剂量组干预后，胆固醇的含量分别较低中剂量组降低更明显（P＜0.05），胞浆中红色脂滴减少，油红O染色效果更弱。
3.水蛭素40ug/ml和黄芪多糖100ug/ml联合干预组较单独水蛭素40ug/ml剂量组、黄芪多糖100ug/ml剂量组降低胆固醇含量更明显，有统计学意义（P＜0.05)，油红O染色效果较弱。
4.与正常组相比较，模型组能够显著增加OX-LDL诱导的巨噬细胞早期、晚期以及总凋亡率，具有统计学意义（P＜0.01）；水蛭素40μg/ml和黄芪多糖100μg/ml联合干预组与模型组相比较，可以显著降低OX-LDL诱导的巨噬细胞早期凋亡率和总凋亡率，具有统计学意义（P＜0.01)。
5.与正常组相比较，模型组巨噬细胞经OX-LDL刺激后线粒体膜电位下降，具有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比较，水蛭素40μg/ml和黄芪多糖100μg/ml联合干预组上调巨噬细胞的线粒体膜电位，具有统计学意义（P＜0.01）。
6.与正常组相比较，模型组细胞内 Caspase3蛋白表达量和Bax蛋白表达量显著上升，Bcl-2蛋白表达量显著下降，有统计学意义（P＜0.01）；与模型组相比较，水蛭素40μg/ml和黄芪多糖100μg/ml药物联合干预后，细胞内 Caspase3和Bax蛋白表达量降低，Bcl-2蛋白表达量升高，具有统计学意义（P＜0.05)。
结论：
1.水蛭素40ug/ml、黄芪多糖100ug/ml和两者联合干预都降低巨噬细胞内的脂质积聚，但水蛭素40ug/ml和黄芪多糖100ug/ml联合干预后疗效优于单独药物作用。
2.水蛭素40ug/ml和黄芪多糖100ug/ml联合干预可降低OX-LDL诱导巨噬细胞凋亡率，其治疗AS作用机制可能与调控线粒体膜电位和相关促凋亡蛋白Caspase3、Bax以及抗凋亡蛋白Bcl-2的表达有关。