论文部分内容阅读
目的：研究杜仲叶水提物对成骨细胞MC3T3-E1的调控作用及分子机制。
方法：采用单因素及正交实验，考察不同料液比、温度、时间、浸提次数对杜仲叶水提物收率及含量的影响，建立杜仲叶水提物制备工艺；采用高效液相色谱法测定杜仲叶的核心成分以及含量；采用CCK-8检测试剂盒测定不同浓度的杜仲叶水提物对成骨细胞MC3T3-E1的增殖影响；通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及定量分析考察杜仲叶水提物对MC3T3-E1细胞增殖及分化的影响；采用转录组测序、生物信息学分析及qRT-PCR等手段和方法研究杜仲叶水提物对MC3T3-E1细胞基因表达的影响，确立其调控成骨细胞的分子机制。
结果：(1)通过对不同温度、时间、浸提次数和料液比等影响因素进行筛选，结果表明在100℃，15min，三次浸提，料液比为1：800的条件下杜仲叶提物的收率最高，可达47.60%。
(2)通过高效液相测定了杜仲叶水提物有效成分含量，结果表明杜仲叶水提物核心成分主要为桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷、芦丁、异槲皮苷、绿原酸和紫云英苷，含量分别为1.18%、4.29%、0.47%、0.13%、0.06%、0.43%、0.13%。
(3)采用CCK-8法测定杜仲叶水提物对成骨细胞的增殖影响，结果表明杜仲叶水提物在浓度为0.05mg/ml条件下对MC3T3-E1细胞具有明显的促增殖作用，且在0.15mg/ml时促增殖作用最佳，因此选择0.15mg/ml的浓度用于后续实验。
(4)通过转录组测序和生物信息学分析与空白组比较，杜仲叶水提物处理组显著上调基因30个，主要为参与调控成骨细胞增殖的基因；显著下调基因604个，主要为参与负调控成骨细胞的基因。通过GO功能富集，这些差异表达基因主要归类到调节初级代谢、调节细胞代谢。进一步进行KEGG富集分析，主要的代谢通路包括功能分类中；通过KEGG代谢通路分析，这些差异表达基因主要归类到Ampk信号通路、细胞周期、TCA周期、mRNA监视通路、NOD样受体信号通路、p53信号通路、RNA转运和TNF信号通路。
(5)通过qRT-PCR验证，结果表明所测基因表达水平与转录组测序结果基本一致，证明了其转录组测序的实验结果真实可信。
结论：本研究制备的杜仲叶水提物基本涵盖了其调控骨生长的核心成分，如桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷、芦丁、绿原酸等，且收率较高。后续活性实验表明杜仲叶水提物可以促进成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化，抑制凋亡。同时，杜仲叶水提物对成骨细胞MC3T3-E1的调控主要是通过上调参与成骨细胞增殖、分化的基因，下调参与抑制成骨细胞增殖，分化的基因，进而影响对细胞区域、细胞内和细胞器内等生物过程，及通过Ampk信号通路、细胞周期、TCA周期、mRNA监视通路、NOD样受体信号通路等信号通路来实现的，这些研究结果为以杜仲叶为代表的骨病治疗药物的开发提供坚实的数据基础和潜在的治疗靶点。
方法：采用单因素及正交实验，考察不同料液比、温度、时间、浸提次数对杜仲叶水提物收率及含量的影响，建立杜仲叶水提物制备工艺；采用高效液相色谱法测定杜仲叶的核心成分以及含量；采用CCK-8检测试剂盒测定不同浓度的杜仲叶水提物对成骨细胞MC3T3-E1的增殖影响；通过碱性磷酸酶染色、茜素红染色及定量分析考察杜仲叶水提物对MC3T3-E1细胞增殖及分化的影响；采用转录组测序、生物信息学分析及qRT-PCR等手段和方法研究杜仲叶水提物对MC3T3-E1细胞基因表达的影响，确立其调控成骨细胞的分子机制。
结果：(1)通过对不同温度、时间、浸提次数和料液比等影响因素进行筛选，结果表明在100℃，15min，三次浸提，料液比为1：800的条件下杜仲叶提物的收率最高，可达47.60%。
(2)通过高效液相测定了杜仲叶水提物有效成分含量，结果表明杜仲叶水提物核心成分主要为桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷、芦丁、异槲皮苷、绿原酸和紫云英苷，含量分别为1.18%、4.29%、0.47%、0.13%、0.06%、0.43%、0.13%。
(3)采用CCK-8法测定杜仲叶水提物对成骨细胞的增殖影响，结果表明杜仲叶水提物在浓度为0.05mg/ml条件下对MC3T3-E1细胞具有明显的促增殖作用，且在0.15mg/ml时促增殖作用最佳，因此选择0.15mg/ml的浓度用于后续实验。
(4)通过转录组测序和生物信息学分析与空白组比较，杜仲叶水提物处理组显著上调基因30个，主要为参与调控成骨细胞增殖的基因；显著下调基因604个，主要为参与负调控成骨细胞的基因。通过GO功能富集，这些差异表达基因主要归类到调节初级代谢、调节细胞代谢。进一步进行KEGG富集分析，主要的代谢通路包括功能分类中；通过KEGG代谢通路分析，这些差异表达基因主要归类到Ampk信号通路、细胞周期、TCA周期、mRNA监视通路、NOD样受体信号通路、p53信号通路、RNA转运和TNF信号通路。
(5)通过qRT-PCR验证，结果表明所测基因表达水平与转录组测序结果基本一致，证明了其转录组测序的实验结果真实可信。
结论：本研究制备的杜仲叶水提物基本涵盖了其调控骨生长的核心成分，如桃叶珊瑚苷、京尼平苷酸、车叶草苷、芦丁、绿原酸等，且收率较高。后续活性实验表明杜仲叶水提物可以促进成骨细胞MC3T3-E1增殖、分化和矿化，抑制凋亡。同时，杜仲叶水提物对成骨细胞MC3T3-E1的调控主要是通过上调参与成骨细胞增殖、分化的基因，下调参与抑制成骨细胞增殖，分化的基因，进而影响对细胞区域、细胞内和细胞器内等生物过程，及通过Ampk信号通路、细胞周期、TCA周期、mRNA监视通路、NOD样受体信号通路等信号通路来实现的，这些研究结果为以杜仲叶为代表的骨病治疗药物的开发提供坚实的数据基础和潜在的治疗靶点。