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肺癌是严重危害人类健康的恶性肿瘤,目前居我国城市居民恶性肿瘤死亡率的首位。因此,探讨肺癌侵袭、转移相关的分子机制,对肺癌的预防、诊断和治疗具有重要意义。近年来,14-3-3蛋白与肺癌关系的研究逐渐成为热点。
14-3-3蛋白是一种高度保守的可溶性酸性蛋白家族[1]。研究表明,14-3-3家族可以和许多信号蛋白,包括激酶、磷酸酶和跨膜受体等结合,在信号传导、细胞周期以及细胞凋亡的调控等方面发挥重要作用[2]。哺乳动物中,14-3-3蛋白有7种亚型(β,γ,ε,η,σ,τ和ζ)[3]。研究显示,在正常肺组织中只能检测到两种亚型:即ε和ζ,而在肺癌中β,γ,σ,τ,ε,ζ均有表达[4]。14-3-3蛋白的亚型与肿瘤的发生密切相关,并被作为潜在的肿瘤抑制基因或致癌基因[5]。因此,深入研究14-3-3蛋白的不同亚型可以为抗癌治疗提供新的思路。
14-3-3ζ是14-3-3家族中一个亚型。目前,14-3-3ζ的确切功能还不明了,对14-3-3ζ的研究大多集中在对凋亡的调控上。细胞凋亡程序失控与恶性肿瘤的发生、发展及预后密不可分。Bcl-2家族是调控凋亡过程最重要的蛋白家族之一,其中的促凋亡因子Bad在肿瘤中的表达具有重要意义。Ichinose等[6]发现,Bad蛋白磷酸化后失活,失活的Bad加剧胶质母细胞瘤和前列腺癌的恶性转化。研究表明,14-3-3ζ可以通过不同机制对凋亡产生抑制效应,其中之一就是对Bcl-2家族的调控[7,8]。14-3-3ζ可与磷酸化的Bad(p-Bad)结合,将其隔离在胞浆,从而阻止Bad与Bcl-2和Bcl-XL的结合,抑制凋亡[7]。Akt是一个丝.苏氨酸激酶,位于磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)的下游,可被许多促细胞生存信号蛋白所激活。Taso等[9]的研究提示Akt的活化参与癌变的早期阶段,是NSCLC(Non-small Cell LungCancer,非小细胞肺癌)发生中的重要事件。Powell等[10]在体外及实体细胞中均发现Akt可以使14-3-3ζ的Ser58磷酸化。14-3-3ζ对细胞凋亡的调控也可能在一定程度上对肿瘤的发生、发展、侵袭和转移进行调控,因此研究非小细胞肺癌中凋亡相关因子的表达及其与14-3-3ζ的相互关系具有重要意义。
恶性肿瘤往往伴有对邻近组织的浸润和远处转移。肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程,而细胞间粘附功能丧失则是其先决条件。研究表明,上皮型钙粘素(E-cad)与细胞间粘附功能异常、上皮肿瘤的增殖、浸润和转移关系最为密切[11]。E-cad的细胞粘附作用与其细胞内的连环蛋白有关,其中β-连环蛋白(β-catenin)对E-cad的功能调节尤为重要。近年来有关14-3-3ζ与粘附关系的研究开始出现。由于粘附在肿瘤侵袭、转移过程中的作用重要而且复杂,因而深入了解14-3-3ζ与粘附之间的关系,可以进一步加深我们对肺癌侵袭、转移机制的认识。
本课题应用免疫组织化学技术、免疫双标、激光共聚焦显微镜技术、WesternBlotting技术及RT-PCR技术,并结合完整的临床资料,探讨14-3-3ζ在T1期非小细胞肺癌中的表达及与肺癌侵袭、转移、预后和凋亡的关系。了解14-3-3ζ蛋白与肺癌的关系并揭示其作用机制,将有可能为人类战胜这种疾病开辟一条新的途径。
实验方法
110例T1期非小细胞肺癌及癌旁组织均来自辽宁医学院2000～2006年手术切除存档蜡块。所有病例均有完整的随访记录,随访截尾日期为2008年4月。生存期的计算从手术日期到随访截尾日期,或由于复发、转移而死亡的日期为止。50例新鲜T1期非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织来自中于国医科大学附属第一临床医院胸外科2007年11月～2008年11月手术切除标本。上述所有患者术前均未接受过放、化疗。
应用免疫组织化学技术及免疫印迹技术检测14-3-3ζ、β-catenin、E-cad以及p-Bad和p-Akt在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达；应用RT-PCR技术检测14-3-3ζmRNA在T1期NSCLC及正常肺组织中含量的变化；应用免疫双标、共聚焦激光扫描显微镜技术观察T1期NSCLC中14-3-3ζ与β-catenin及14-3-3ζ与E-cad的表达和共存。
实验结果
一、14-3-3ζ在T1期NSCLC中的表达
我们通过免疫组化、Western Blotting及RT-PCR技术检测14-3-3ζ蛋白及14-3-3ζmRNA在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,T1期NSCLC中14-3-3ζ表达较正常肺组织明显增强。14-3-3ζ的表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关。但随着肺癌分化程度的降低,14-3-3ζ的表达逐渐增强。在淋巴结转移阳性的癌组织中,14-3-3ζ表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。生存曲线分析显示14-3-3ζ表达阴性患者的5年生存率及平均生存时间均高于表达阳性者。
二、ζ-catenin在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化、Western Blotting、免疫荧光双标及激光扫描共聚焦显微镜技术检测β-catenin蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,T1期NSCLC中β-catenin的异常表达率明显增高。Β-catenin的异常表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与癌组织分化程度相关。在高分化的癌组织中,β-catenin异常表达率较低；在低分化癌组织中,β-catenin异常表达率较高。在淋巴结转移阳性的癌组织中,β-catenin异常表达率明显高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示β-catenin异常表达与14-3-3ζ阳性表达呈显著负相关。
三、E-cad在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化、Western Blotting、免疫荧光双标及激光扫描共聚焦显微镜技术检测E-cad蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,在NSCLC中E-cad多表现为膜表达减弱或缺失。E-cad的异常表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与癌组织分化程度相关。在高分化癌组织中,E-cad异常表达率较低；在低分化癌组织中,E-cad异常表达率较高。在淋巴结转移阳性的癌组织中E-cad异常表达率明显高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示E-cad的异常表达与14-3-3ζ阳性表达呈显著负相关。
四、p-Bad在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化及Western Blotting技术检测p-Bad蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,在正常肺组织中。P-Bad轻微表达,而在NSCLC中表达显著增强。P-Bad的表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,但与癌组织分化程度、淋巴结转移相关。随着肺癌分化程度的降低,p-Bad的表达逐渐增强；在淋巴结转移阳性的癌组织中,p-Bad表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示p-Bad蛋白与14-3-3ζ在T1期NSCLC中的表达明显正相关。
五、p-Akt在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化及Western Blotting技术检测p-Akt蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,在正常肺组织中p-Akt无表达,而在NSCLC中表达显著增强。P-Akt的表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,但与癌组织分化程度、淋巴结转移相关。随着肺癌分化程度的降低,p-Akt的表达逐渐增强；而在淋巴结转移阳性的癌组织中,p-Akt表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示p-Akt蛋白与14-3-3ζ在T1期NSCLC中的表达明显正相关。
结论：
1.14-3-3ζ在T1期NSCLC中高表达,且其表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与癌组织分化程度、淋巴结转移及患者预后密切相关,提示14-3-3ζ有可能作为判断T1期NSCLC发展与预后的生物学指标之一。
2.βζ-catenin、E-cad在T1期NSCLC表达明显低于正常肺组织。Β-catenin、E-cad异常表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与肺癌分化程度及淋巴结转移密切相关,提示β-catenin、E-cad可能参与了NSCLC的发展和转移。
3.β-catenin、E-cad在T1期NSCLC中的异常表达与14-3-3ζ阳性表达呈明显负相关,提示14-3-3ζ的高表达可能导致了E-cad、β-catenin异常表达,从而对非小细胞肺癌的侵袭和转移产生影响。
4.p-Bad、p-Akt在T1期NSCLC中高表达,且与癌组织分化程度及淋巴结转移密切相关,提示p-Bad、p-Akt可能参与了NSCLC的发展和转移。
5.14-3-3ζ与p-Bad、p-Akt在T1期NSCLC中表达呈正相关,提示14-3-3ζ可能与p-Bad和p-Akt相互作用,共同参与NSCLC凋亡的调控。
14-3-3蛋白是一种高度保守的可溶性酸性蛋白家族[1]。研究表明,14-3-3家族可以和许多信号蛋白,包括激酶、磷酸酶和跨膜受体等结合,在信号传导、细胞周期以及细胞凋亡的调控等方面发挥重要作用[2]。哺乳动物中,14-3-3蛋白有7种亚型(β,γ,ε,η,σ,τ和ζ)[3]。研究显示,在正常肺组织中只能检测到两种亚型:即ε和ζ,而在肺癌中β,γ,σ,τ,ε,ζ均有表达[4]。14-3-3蛋白的亚型与肿瘤的发生密切相关,并被作为潜在的肿瘤抑制基因或致癌基因[5]。因此,深入研究14-3-3蛋白的不同亚型可以为抗癌治疗提供新的思路。
14-3-3ζ是14-3-3家族中一个亚型。目前,14-3-3ζ的确切功能还不明了,对14-3-3ζ的研究大多集中在对凋亡的调控上。细胞凋亡程序失控与恶性肿瘤的发生、发展及预后密不可分。Bcl-2家族是调控凋亡过程最重要的蛋白家族之一,其中的促凋亡因子Bad在肿瘤中的表达具有重要意义。Ichinose等[6]发现,Bad蛋白磷酸化后失活,失活的Bad加剧胶质母细胞瘤和前列腺癌的恶性转化。研究表明,14-3-3ζ可以通过不同机制对凋亡产生抑制效应,其中之一就是对Bcl-2家族的调控[7,8]。14-3-3ζ可与磷酸化的Bad(p-Bad)结合,将其隔离在胞浆,从而阻止Bad与Bcl-2和Bcl-XL的结合,抑制凋亡[7]。Akt是一个丝.苏氨酸激酶,位于磷脂酰肌醇-3-激酶(PI3-K)的下游,可被许多促细胞生存信号蛋白所激活。Taso等[9]的研究提示Akt的活化参与癌变的早期阶段,是NSCLC(Non-small Cell LungCancer,非小细胞肺癌)发生中的重要事件。Powell等[10]在体外及实体细胞中均发现Akt可以使14-3-3ζ的Ser58磷酸化。14-3-3ζ对细胞凋亡的调控也可能在一定程度上对肿瘤的发生、发展、侵袭和转移进行调控,因此研究非小细胞肺癌中凋亡相关因子的表达及其与14-3-3ζ的相互关系具有重要意义。
恶性肿瘤往往伴有对邻近组织的浸润和远处转移。肿瘤的侵袭和转移是一个多步骤、多因素参与的极其复杂的过程,而细胞间粘附功能丧失则是其先决条件。研究表明,上皮型钙粘素(E-cad)与细胞间粘附功能异常、上皮肿瘤的增殖、浸润和转移关系最为密切[11]。E-cad的细胞粘附作用与其细胞内的连环蛋白有关,其中β-连环蛋白(β-catenin)对E-cad的功能调节尤为重要。近年来有关14-3-3ζ与粘附关系的研究开始出现。由于粘附在肿瘤侵袭、转移过程中的作用重要而且复杂,因而深入了解14-3-3ζ与粘附之间的关系,可以进一步加深我们对肺癌侵袭、转移机制的认识。
本课题应用免疫组织化学技术、免疫双标、激光共聚焦显微镜技术、WesternBlotting技术及RT-PCR技术,并结合完整的临床资料,探讨14-3-3ζ在T1期非小细胞肺癌中的表达及与肺癌侵袭、转移、预后和凋亡的关系。了解14-3-3ζ蛋白与肺癌的关系并揭示其作用机制,将有可能为人类战胜这种疾病开辟一条新的途径。
实验方法
110例T1期非小细胞肺癌及癌旁组织均来自辽宁医学院2000～2006年手术切除存档蜡块。所有病例均有完整的随访记录,随访截尾日期为2008年4月。生存期的计算从手术日期到随访截尾日期,或由于复发、转移而死亡的日期为止。50例新鲜T1期非小细胞肺癌及癌旁正常肺组织来自中于国医科大学附属第一临床医院胸外科2007年11月～2008年11月手术切除标本。上述所有患者术前均未接受过放、化疗。
应用免疫组织化学技术及免疫印迹技术检测14-3-3ζ、β-catenin、E-cad以及p-Bad和p-Akt在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达；应用RT-PCR技术检测14-3-3ζmRNA在T1期NSCLC及正常肺组织中含量的变化；应用免疫双标、共聚焦激光扫描显微镜技术观察T1期NSCLC中14-3-3ζ与β-catenin及14-3-3ζ与E-cad的表达和共存。
实验结果
一、14-3-3ζ在T1期NSCLC中的表达
我们通过免疫组化、Western Blotting及RT-PCR技术检测14-3-3ζ蛋白及14-3-3ζmRNA在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,T1期NSCLC中14-3-3ζ表达较正常肺组织明显增强。14-3-3ζ的表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关。但随着肺癌分化程度的降低,14-3-3ζ的表达逐渐增强。在淋巴结转移阳性的癌组织中,14-3-3ζ表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。生存曲线分析显示14-3-3ζ表达阴性患者的5年生存率及平均生存时间均高于表达阳性者。
二、ζ-catenin在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化、Western Blotting、免疫荧光双标及激光扫描共聚焦显微镜技术检测β-catenin蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,T1期NSCLC中β-catenin的异常表达率明显增高。Β-catenin的异常表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与癌组织分化程度相关。在高分化的癌组织中,β-catenin异常表达率较低；在低分化癌组织中,β-catenin异常表达率较高。在淋巴结转移阳性的癌组织中,β-catenin异常表达率明显高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示β-catenin异常表达与14-3-3ζ阳性表达呈显著负相关。
三、E-cad在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化、Western Blotting、免疫荧光双标及激光扫描共聚焦显微镜技术检测E-cad蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,在NSCLC中E-cad多表现为膜表达减弱或缺失。E-cad的异常表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与癌组织分化程度相关。在高分化癌组织中,E-cad异常表达率较低；在低分化癌组织中,E-cad异常表达率较高。在淋巴结转移阳性的癌组织中E-cad异常表达率明显高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示E-cad的异常表达与14-3-3ζ阳性表达呈显著负相关。
四、p-Bad在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化及Western Blotting技术检测p-Bad蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,在正常肺组织中。P-Bad轻微表达,而在NSCLC中表达显著增强。P-Bad的表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,但与癌组织分化程度、淋巴结转移相关。随着肺癌分化程度的降低,p-Bad的表达逐渐增强；在淋巴结转移阳性的癌组织中,p-Bad表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示p-Bad蛋白与14-3-3ζ在T1期NSCLC中的表达明显正相关。
五、p-Akt在T1期NSCLC中的表达及与14-3-3ζ的关系
我们通过免疫组化及Western Blotting技术检测p-Akt蛋白在T1期NSCLC及正常肺组织中的表达。结果显示,在正常肺组织中p-Akt无表达,而在NSCLC中表达显著增强。P-Akt的表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,但与癌组织分化程度、淋巴结转移相关。随着肺癌分化程度的降低,p-Akt的表达逐渐增强；而在淋巴结转移阳性的癌组织中,p-Akt表达高于淋巴结转移阴性的癌组织。统计学分析显示p-Akt蛋白与14-3-3ζ在T1期NSCLC中的表达明显正相关。
结论：
1.14-3-3ζ在T1期NSCLC中高表达,且其表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与癌组织分化程度、淋巴结转移及患者预后密切相关,提示14-3-3ζ有可能作为判断T1期NSCLC发展与预后的生物学指标之一。
2.βζ-catenin、E-cad在T1期NSCLC表达明显低于正常肺组织。Β-catenin、E-cad异常表达与患者的年龄、性别及病理学分型无关,而与肺癌分化程度及淋巴结转移密切相关,提示β-catenin、E-cad可能参与了NSCLC的发展和转移。
3.β-catenin、E-cad在T1期NSCLC中的异常表达与14-3-3ζ阳性表达呈明显负相关,提示14-3-3ζ的高表达可能导致了E-cad、β-catenin异常表达,从而对非小细胞肺癌的侵袭和转移产生影响。
4.p-Bad、p-Akt在T1期NSCLC中高表达,且与癌组织分化程度及淋巴结转移密切相关,提示p-Bad、p-Akt可能参与了NSCLC的发展和转移。
5.14-3-3ζ与p-Bad、p-Akt在T1期NSCLC中表达呈正相关,提示14-3-3ζ可能与p-Bad和p-Akt相互作用,共同参与NSCLC凋亡的调控。