【摘 要】
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灿烂弧菌(Vibrio splendidus)是养殖刺参的主要致病菌之一,可引起刺参腐皮综合症,死亡率高达90%,还可引起养殖牙鲆、大菱鲆、鳟鱼、大西洋鲑、鲈鱼等的多种疾病。目前针对灿
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灿烂弧菌(Vibrio splendidus)是养殖刺参的主要致病菌之一,可引起刺参腐皮综合症,死亡率高达90%,还可引起养殖牙鲆、大菱鲆、鳟鱼、大西洋鲑、鲈鱼等的多种疾病。目前针对灿烂弧菌的检测方法包括基于细菌培养的常规检测技术(涂布平板法,生理生化指标鉴定等),基于抗原抗体反应的免疫学方法(玻片凝集法,双抗夹心ELISA, Dot-ELISA,间接荧光检测等)和基于DNA检测的分子生物学方法(PCR法,核酸探针杂交等)。这些方法具有步骤繁琐、所需设备昂贵、耗时长、对操作人员的技术要求较高等特点,一定程度上限制了其在海水养殖基层的应用推广。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification, LAMP)技术是2000年由Notomi开发出的一种新型的核酸扩增技术。其利用特殊设计的引物和具有链置换活性的DNA聚合酶,在等温条件下进行基因高效扩增,具有操作简单、成本低廉、快速高效等优点,已在许多人类疾病的检测和诊断中应用。利用LAMP技术,建立、完善一种快速高效、简便易行的灿烂弧菌检测方法,进行灿烂弧菌病的预防和现场快速诊断,减少、减轻因灿烂弧菌感染所造成的经济损失,对海水养殖业的健康发展具有较好的经济和社会意义。本研究通过生物信息学分析,参照弧菌毒力因子数据库(VFDB)和GenBank中灿烂弧菌的基因组信息,筛选用于LAMP引物设计的灿烂弧菌中潜在的毒力相关基因,通过蛋白保守区域分析和基因同源比对,利用在线引物设计程序设计引物并合成。结合实验分析,选定灿烂弧菌鞭毛相关基因flgF进行条件优化,检测了LAMP反应体系中dNTP、Betaine、Mg2+浓度以及反应时间对LAMP的影响,优化并确定了最佳反应条件。以PCR为对照,分析了LAMP法检测灿烂弧菌的特异性和灵敏度,并对比了几种LAMP结果的肉眼分析方法。为开发基于LAMP技术的海水养殖中灿烂弧菌快速检测试剂(盒)奠定基础。本研究获得的实验结果如下：1、用于灿烂弧菌LAMP’快速检测的引物为：正向外引物F3:5’-GGATCGCGCACTGTTTCT-3’反向外引物B3:5’-TGTGCGAAATTATGACCCGG-3’正向内引物FIP：5’-ACCCGTTGTACTTACGTTGGCAGCCATGAGTGGCGCTAAG-3’反向内引物BIP：5’-AGCACAAGCACGTTCAATGC AACCGTCATGCTGAAAACACGA-3’;2、最佳反应体系：F3和B3,0.2HM; FIP和BIP,1.6μM; dNTP,1.0mM; Betaine,0.1M; Mg2+,5.0mM;模板1μL; Bst DNA聚合酶缓冲液(10×),2.5μL；Bst DNA聚合酶(大片段)为8U,加水补至25μL。最佳反应时间为30min-45min。3、特异性分析：对16株待测菌株培养物和DNA检测中,灿烂弧菌的阳性检出率为100%,与其他菌株未出现明显的交叉反应。4、灵敏度分析：检测灿烂弧菌基因组DNA的最低限度为38fg/μL,检测灿烂弧菌纯培养物的最低限度为1.3×103cfu/mL,均高于常规PCR两个数量级。5、结果判读：Calcein-Mn2+可实现结果的闭管快速判读。利用环介导等温扩增技术(LAMP)检测灿烂弧菌的方法具有特异性好,灵敏度高,反应迅速,结果易判读等优点,具有一定的应用开发价值。
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