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胃癌是常见的恶性肿瘤之一，发病率仅次于肺癌，死亡率较高。胃癌早期确诊困难，大多数患者确诊时已处于晚期，已错过最佳治疗时间。胃癌的发生和发展是一个多步骤、多因素的复杂过程。因此，深入研究胃癌的发病机制、寻找新的生物学治疗靶点对于胃癌的诊断、有效治疗方案的制定以及预后的预测均具有重要的意义。
近年来的研究发现，长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)被报道与肿瘤细胞的增殖、侵袭以及转移相关。多项研究证明，lncRNAs在胃癌的发生和发展中发挥着重要的作用。比如：lncRNAHEIG是胃癌中潜在的致癌因子，它可以通过调控PI3K-Akt信号通路的活性，从而抑制胃癌移植瘤的生长。研究发现，lncRNAGAS5(growtharrest-specific5，生长特异抑制物5)不仅在哺乳动物的细胞生长、分化和发育过程中都起着重要的作用，另外GAS5在多种癌症中还发挥抑癌的作用，比如：乳腺癌、膀胱癌以及肺癌等。然而，目前GAS5在胃癌中的作用及机制还未有报道。
据研究显示，microRNA(miRNA)在发育、代谢、细胞分化、增殖、迁移、传导、细胞死亡和应激等生理和病理过程中起着重要的作用。miR-106a-5p能够靶向CD117，进而促进细胞的迁移和增殖，起到致癌的作用。据研究显示，miR-106a-5p在乳头状甲状腺癌(PTC)中表达明显上调，可能通过参与Wnt信号通路，影响PTC细胞增殖、代谢以及细胞内基因表达等，有成为PTC标记分子的潜力。但是，目前miR-106a-5p在胃癌中的表达及作用机制还未有研究。
据研究显示，lncRNA可作为miRNA的“分子海绵”，它可以通过碱基互补配对与miRNA结合，进而调控下游靶基因的表达，或者下游信号通路的活性，从而对细胞产生影响。例如：lncRNAGACAT3通过调控miR-149的表达，可以促进结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。本研究前期使用生物信息学软件Megalign预测了GAS5和miR-106a-5p的结合位点，推测GAS5和miR-106a-5p在胃癌的发生和发展中可能起着重要的作用。
本课题为研究长链非编码RNAGAS5吸附miR-106a-5p在胃癌中的调控作用及机制，首先利用qRT-PCR检测了GAS5、miR-106a-5p在胃癌组织、细胞以及不同分期中的表达水平，并用Graphpadprism6软件对GAS5和miR-106a-5p的表达水平进行了相关性分析，使用生物信息学软件Megalign预测了GAS5和miR-106a-5p的关系；另外，利用双荧光素酶实验验证GAS5和miR-106a-5p有结合序列，并构建GAS5过表达和miR-106a-5p过表达两种慢病毒载体，经感染得到GAS5过表达、GAS5和miR-106a-5p同时共表达胃癌细胞，并利用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术、Transwell和划痕实验检测了GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响，并利用Westernblot检测了GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞中Akt/mTOR信号通路的影响；最后，拟体内研究，利用SGC-7901细胞移植构建胃癌移植瘤小鼠模型，检测了GAS5吸附miR-106a-5p对移植瘤生长以及Akt/mTOR信号通路的影响。
本研究主要探讨长链非编码RNAGAS5吸附miR-106a-5p在胃癌中的调控作用及其机制，为将来胃癌的早期诊断、预后判断以及治疗方案的制定等提供了潜在的生物学靶点。本研究主要分为三部分：
第一部分：GAS5、miR-106a-5p在胃癌中的表达及意义；
第二部分：GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞生物学的影响及机制研究；
第三部分：GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌移植瘤生长的影响及机制研究。
主要内容：
第一部分GAS5、miR-106a-5p在胃癌中的表达及意义
方法
1.HE染色观察胃癌的组织形态。
2.qRT-PCR检测GAS5和miR-106a-5p的表达情况。
3.使用Graphpadprism6软件对GAS5和miR-106a-5p在胃癌中的表达水平进行相关性分析。
4.生物信息学软件Megalign预测GAS5和miR-106a-5p的结合位点。
结果
1.HE染色结果发现，癌旁正常组织胃壁由内向外分四层：粘膜层、粘膜下层、肌层、浆膜层；胃癌组织学类型以腺癌为主。
2.与癌旁正常组织相比，GAS5在胃癌组织中明显低表达，而miR-106a-5p明显过表达。GAS5在stage3/4期胃癌中的表达量明显低于stage1/2期。
3.与正常细胞RGM-1相比，GAS5在胃癌细胞系HCG-27、SGC-7901中明显低表达，而miR-106a-5p明显过表达。
4.Graphpadprism6软件分析发现在胃癌中GAS5和miR-106a-5p的表达水平呈负相关。
5.生物信息学软件Megalign预测GAS5和miR-106a-5p有结合位点。
第二部分GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞生物学的影响及机制研究
方法
1.双荧光素酶报告基因实验验证GAS5与miR-106a-5p的关系。
2.构建Lent-GAS5和Lent-miR-106a-5p两种慢病毒载体，对重组慢病毒进行病毒包装及滴定，用LV-GAS5慢病毒感染HCG-27和SGC-7901细胞，得到HCG-27-GAS5和SGC-7901-GAS5，又用LV-miR-106a-5p慢病毒感染HCG-27-GAS5和SGC-7901-GAS5细胞，获得HCG-27-GAS5+miR-106a-5p和SGC-7901-GAS5+miR-106a-5p细胞。
3.qRT-PCR检测GAS5过表达对HCG-27和SGC-7901细胞中miR-106a-5p表达的影响。
4.CCK-8检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞中增殖的影响。
5.克隆形成实验检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞克隆形成的影响。
6.流式细胞术检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞凋亡的影响。
7.Transwell检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞侵袭的影响。
8.划痕实验检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞迁移的影响。
9.Westernblot检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞中Akt/mTOR信号通路的影响。
结果
1.双荧光素酶报告基因实验验证GAS5与miR-106a-5p有结合序列。
2.Lent-GAS5和Lent-miR-106a-5p两种慢病毒载体菌落PCR以及基因测序结果与NCBI上一致，说明两种慢病毒载体构建成功。经测定LV-GAS5和LV-miR-106a-5p病毒滴定值为3×107.69TU/mL。
3.在胃癌细胞系HCG-27和SGC-7901中，GAS5过表达可吸附并抑制miR-106a-5p的表达，进而抑制Akt/mTOR信号通路的活性，从而抑制细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移，并促进细胞凋亡。
第三部分GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌移植瘤生长的影响及机制研究
方法
1.利用SGC-7901细胞进行移植，构建胃癌移植瘤小鼠模型，并检测移植瘤的体积和重量。
2.qRT-PCR检测GAS5过表达对miR-106a-5p表达的影响。
3.HE染色观察胃癌移植瘤组织形态。
4.免疫组化检测增殖相关蛋白Ki-67的表达。
5.Westernblot检测GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌移植瘤中Akt/mTOR信号通路的影响。
结果
1.成功构建SGC-7901-vector、SGC-7901-GAS5、SGC-7901-GAS5+miR-106a-5p3组胃癌荷瘤小鼠模型。
2.对移植瘤的体积和质量检测发现，GAS5过表达可以明显抑制胃癌移植瘤的生长，而miR-106a-5p过表达减弱了这种抑制作用。
3.qRT-PCR检测发现，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达可以明显抑制miR-106a-5p的表达，而GAS5和miR-106a-5p共表达后miR-106a-5p的表达明显升高。
4.HE染色结果发现，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达后移植瘤恶性程度明显增高，而GAS5和miR-106a-5p共表达后恶性程度又明显降低。
5.免疫组化检测结果显示，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达可以明显抑制增殖相关蛋白Ki-67的表达，而GAS5和miR-106a-5p同时过表达后促进Ki-67的表达。
6.Westernblot检测发现，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达可以明显抑制Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR的表达，而miR-106a-5p过表达则逆转这种作用。
全文结论
1.在胃癌组织和细胞中GAS5明显低表达，而miR-106a-5p明显过表达，且二者的表达水平呈负相关。
2.GAS5能够吸附并抑制miR-106a-5p的表达。
3.在胃癌中，GAS5过表达可通过吸附miR-106a-5p，进而抑制Akt/mTOR信号通路的活性，从而抑制细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移以及胃癌移植瘤的生长，并促进细胞凋亡。
近年来的研究发现，长链非编码RNA(long non-coding RNAs，lncRNAs)被报道与肿瘤细胞的增殖、侵袭以及转移相关。多项研究证明，lncRNAs在胃癌的发生和发展中发挥着重要的作用。比如：lncRNAHEIG是胃癌中潜在的致癌因子，它可以通过调控PI3K-Akt信号通路的活性，从而抑制胃癌移植瘤的生长。研究发现，lncRNAGAS5(growtharrest-specific5，生长特异抑制物5)不仅在哺乳动物的细胞生长、分化和发育过程中都起着重要的作用，另外GAS5在多种癌症中还发挥抑癌的作用，比如：乳腺癌、膀胱癌以及肺癌等。然而，目前GAS5在胃癌中的作用及机制还未有报道。
据研究显示，microRNA(miRNA)在发育、代谢、细胞分化、增殖、迁移、传导、细胞死亡和应激等生理和病理过程中起着重要的作用。miR-106a-5p能够靶向CD117，进而促进细胞的迁移和增殖，起到致癌的作用。据研究显示，miR-106a-5p在乳头状甲状腺癌(PTC)中表达明显上调，可能通过参与Wnt信号通路，影响PTC细胞增殖、代谢以及细胞内基因表达等，有成为PTC标记分子的潜力。但是，目前miR-106a-5p在胃癌中的表达及作用机制还未有研究。
据研究显示，lncRNA可作为miRNA的“分子海绵”，它可以通过碱基互补配对与miRNA结合，进而调控下游靶基因的表达，或者下游信号通路的活性，从而对细胞产生影响。例如：lncRNAGACAT3通过调控miR-149的表达，可以促进结肠癌细胞的增殖、侵袭和迁移。本研究前期使用生物信息学软件Megalign预测了GAS5和miR-106a-5p的结合位点，推测GAS5和miR-106a-5p在胃癌的发生和发展中可能起着重要的作用。
本课题为研究长链非编码RNAGAS5吸附miR-106a-5p在胃癌中的调控作用及机制，首先利用qRT-PCR检测了GAS5、miR-106a-5p在胃癌组织、细胞以及不同分期中的表达水平，并用Graphpadprism6软件对GAS5和miR-106a-5p的表达水平进行了相关性分析，使用生物信息学软件Megalign预测了GAS5和miR-106a-5p的关系；另外，利用双荧光素酶实验验证GAS5和miR-106a-5p有结合序列，并构建GAS5过表达和miR-106a-5p过表达两种慢病毒载体，经感染得到GAS5过表达、GAS5和miR-106a-5p同时共表达胃癌细胞，并利用CCK-8、克隆形成实验、流式细胞术、Transwell和划痕实验检测了GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞增殖、克隆形成、凋亡、侵袭和迁移的影响，并利用Westernblot检测了GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞中Akt/mTOR信号通路的影响；最后，拟体内研究，利用SGC-7901细胞移植构建胃癌移植瘤小鼠模型，检测了GAS5吸附miR-106a-5p对移植瘤生长以及Akt/mTOR信号通路的影响。
本研究主要探讨长链非编码RNAGAS5吸附miR-106a-5p在胃癌中的调控作用及其机制，为将来胃癌的早期诊断、预后判断以及治疗方案的制定等提供了潜在的生物学靶点。本研究主要分为三部分：
第一部分：GAS5、miR-106a-5p在胃癌中的表达及意义；
第二部分：GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞生物学的影响及机制研究；
第三部分：GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌移植瘤生长的影响及机制研究。
主要内容：
第一部分GAS5、miR-106a-5p在胃癌中的表达及意义
方法
1.HE染色观察胃癌的组织形态。
2.qRT-PCR检测GAS5和miR-106a-5p的表达情况。
3.使用Graphpadprism6软件对GAS5和miR-106a-5p在胃癌中的表达水平进行相关性分析。
4.生物信息学软件Megalign预测GAS5和miR-106a-5p的结合位点。
结果
1.HE染色结果发现，癌旁正常组织胃壁由内向外分四层：粘膜层、粘膜下层、肌层、浆膜层；胃癌组织学类型以腺癌为主。
2.与癌旁正常组织相比，GAS5在胃癌组织中明显低表达，而miR-106a-5p明显过表达。GAS5在stage3/4期胃癌中的表达量明显低于stage1/2期。
3.与正常细胞RGM-1相比，GAS5在胃癌细胞系HCG-27、SGC-7901中明显低表达，而miR-106a-5p明显过表达。
4.Graphpadprism6软件分析发现在胃癌中GAS5和miR-106a-5p的表达水平呈负相关。
5.生物信息学软件Megalign预测GAS5和miR-106a-5p有结合位点。
第二部分GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌细胞生物学的影响及机制研究
方法
1.双荧光素酶报告基因实验验证GAS5与miR-106a-5p的关系。
2.构建Lent-GAS5和Lent-miR-106a-5p两种慢病毒载体，对重组慢病毒进行病毒包装及滴定，用LV-GAS5慢病毒感染HCG-27和SGC-7901细胞，得到HCG-27-GAS5和SGC-7901-GAS5，又用LV-miR-106a-5p慢病毒感染HCG-27-GAS5和SGC-7901-GAS5细胞，获得HCG-27-GAS5+miR-106a-5p和SGC-7901-GAS5+miR-106a-5p细胞。
3.qRT-PCR检测GAS5过表达对HCG-27和SGC-7901细胞中miR-106a-5p表达的影响。
4.CCK-8检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞中增殖的影响。
5.克隆形成实验检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞克隆形成的影响。
6.流式细胞术检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞凋亡的影响。
7.Transwell检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞侵袭的影响。
8.划痕实验检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞迁移的影响。
9.Westernblot检测GAS5吸附miR-106a-5p对HCG-27和SGC-7901细胞中Akt/mTOR信号通路的影响。
结果
1.双荧光素酶报告基因实验验证GAS5与miR-106a-5p有结合序列。
2.Lent-GAS5和Lent-miR-106a-5p两种慢病毒载体菌落PCR以及基因测序结果与NCBI上一致，说明两种慢病毒载体构建成功。经测定LV-GAS5和LV-miR-106a-5p病毒滴定值为3×107.69TU/mL。
3.在胃癌细胞系HCG-27和SGC-7901中，GAS5过表达可吸附并抑制miR-106a-5p的表达，进而抑制Akt/mTOR信号通路的活性，从而抑制细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移，并促进细胞凋亡。
第三部分GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌移植瘤生长的影响及机制研究
方法
1.利用SGC-7901细胞进行移植，构建胃癌移植瘤小鼠模型，并检测移植瘤的体积和重量。
2.qRT-PCR检测GAS5过表达对miR-106a-5p表达的影响。
3.HE染色观察胃癌移植瘤组织形态。
4.免疫组化检测增殖相关蛋白Ki-67的表达。
5.Westernblot检测GAS5吸附miR-106a-5p对胃癌移植瘤中Akt/mTOR信号通路的影响。
结果
1.成功构建SGC-7901-vector、SGC-7901-GAS5、SGC-7901-GAS5+miR-106a-5p3组胃癌荷瘤小鼠模型。
2.对移植瘤的体积和质量检测发现，GAS5过表达可以明显抑制胃癌移植瘤的生长，而miR-106a-5p过表达减弱了这种抑制作用。
3.qRT-PCR检测发现，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达可以明显抑制miR-106a-5p的表达，而GAS5和miR-106a-5p共表达后miR-106a-5p的表达明显升高。
4.HE染色结果发现，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达后移植瘤恶性程度明显增高，而GAS5和miR-106a-5p共表达后恶性程度又明显降低。
5.免疫组化检测结果显示，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达可以明显抑制增殖相关蛋白Ki-67的表达，而GAS5和miR-106a-5p同时过表达后促进Ki-67的表达。
6.Westernblot检测发现，与SGC-7901-vector组相比，GAS5过表达可以明显抑制Akt/mTOR信号通路相关蛋白p-Akt、p-mTOR的表达，而miR-106a-5p过表达则逆转这种作用。
全文结论
1.在胃癌组织和细胞中GAS5明显低表达，而miR-106a-5p明显过表达，且二者的表达水平呈负相关。
2.GAS5能够吸附并抑制miR-106a-5p的表达。
3.在胃癌中，GAS5过表达可通过吸附miR-106a-5p，进而抑制Akt/mTOR信号通路的活性，从而抑制细胞增殖、克隆形成、侵袭、迁移以及胃癌移植瘤的生长，并促进细胞凋亡。