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前言：
流行病学研究结果表明，随着糖尿病及糖尿病前期在全世界范围内的流行，糖尿病相关并发症也越来越多。糖尿病慢性并发症的发生发展不仅与血糖整体水平升高有关，而且与血糖波动(glucose variability，GV)密切相关。GV是指血糖水平在其高峰和低谷之间变化的不稳定状态。糖尿病患者常因胰岛功能下降和胰岛素抵抗，对血糖的调节能力变差。胰岛β细胞功能越差，GV的幅度越高。GV已是糖尿病慢性并发症的独立危险因素。糖尿病神经病变(diabetic neuropathy，DN)是糖尿病常见慢性并发症之一，随着病程进展，超过50%的患者可合并神经并发症，包括中枢神经病变及周围神经病变。
认知功能障碍是糖尿病中枢神经病变的常见临床表现类型，患者会出现学习、记忆及复杂的信息处理能力下降，严重者甚至痴呆。近年来有研究发现，GV是认知功能障碍和痴呆的危险因素，而具体机制尚不明确。Tau蛋白是广泛存在于神经元内的微管相关蛋白，与微管的组装及稳定性密切相关。海马中Tau蛋白过度磷酸化与神经细胞变性和认知功能障碍密切相关。动物模型中发现糖尿病大鼠的海马超微结构破坏明显，细胞内Tau蛋白过度磷酸化。GV是否通过增加海马中Tau蛋白磷酸化影响认知功能尚不清楚。研究发现，Akt/GSK3β信号通路参与了Tau蛋白的异常磷酸化。与单纯高血糖相比，GV是否通过Akt/GSK3β信号通路加重了海马组织内Tau蛋白磷酸化有待进一步研究。
除了认知功能障碍，众多研究发现GV与糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)患者的临床严重程度有密切关系。线粒体功能紊乱、氧化应激及炎症反应参与DPN的发生发展。我们前期研究发现，糖尿病大鼠的坐骨神经线粒体中出现了心磷脂(cardiolipin，CL)的病态重构，其线粒体功能受损。研究发现，线粒体功能紊乱将导致活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成增多，机体氧化和抗氧化防御的平衡被打破，引起氧化应激反应并激活NF-κB等转录因子启动和放大神经元局部的炎症反应。与单纯高糖相比，GV是否会加重周围神经线粒体功能紊乱、氧化应激和炎症反应有待于进一步验证。
本实验通过构建血糖波动糖尿病大鼠模型，评价其认知功能、检测海马区域Tau蛋白的磷酸化水平及Akt/GSK3β信号的表达情况。其次，观察坐骨神经的超微结构和功能变化，明确坐骨神经中ALCAT1表达情况，评估坐骨神经中氧化应激指标丙二醛(malondialdehyde，MDA)和抗氧化应激指标超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase，SOD)、炎症因子TNF-α、IL-6及其连接枢纽NF-κB表达水平。
目的：
1.观察血糖波动对糖尿病大鼠认知功能的影响。
2.评价血糖波动对糖尿病大鼠海马中Tau蛋白磷酸化的作用和Akt/GSK3β信号通路的影响，探讨血糖波动所致认知功能障碍的可能机制。
3.观察血糖波动糖尿病大鼠坐骨神经超微结构和功能的影响。
4.明确血糖波动对坐骨神经局部ALCAT1表达、氧化应激和炎症反应指标的作用。
方法：
1.糖尿病及血糖波动大鼠模型的建立：(1)8周龄的雄性SD大鼠随机化分为3组，对照组(NC组)、持续高糖组(DS组)和血糖波动组(DF组)。DS组和DF组给予腹腔内注射STZ诱导糖尿病模型，DF组大鼠每日在特定时间交替腹腔内注射50%葡萄糖液(2g/kg)及皮下注射普通胰岛素(20U/kg)构建血糖波动模型。给予DS组和NC组给予相同体积的生理盐水腹腔或皮下注射，共计12周。(2)每两周检测大鼠体重，每两周固定测一日内6点(6:30、9:30、12:30、15:30、18:30和21:30)血糖水平，计算各组大鼠的平均血糖(MBG)、血糖标准差(SDBG)及最大血糖波动幅度(LAGE)。(3)在实验第8周和第12周时测定糖化血红蛋白(HbA1c)。
2.实验第8周时对各组大鼠的认知功能进行评估：(1)应用跳台实验评价大鼠的认知功能：包括学习能力和记忆能力。(2)免疫组化法分析大鼠海马组织中磷酸化的Tau蛋白(p-Tau)及总的Tau蛋白(Tau)表达水平。(3)Westernblot法检测大鼠海马组织中GSK3β及Akt信号通路的变化。
3.实验第12周时对各组大鼠周围神经功能进行评估：(1)应用神经电生理检测大鼠坐骨神经的运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity ， MNCV)。(2)应用电子显微镜观察大鼠坐骨神经的超微结构。(3)Westernblot法检测大鼠坐骨神经中ALCAT1的蛋白表达水平。(4)羟胺法测定SOD的活性，比色法测定大鼠坐骨神经中MDA的含量。(5)ELISA法检测坐骨神经中TNF-α和IL-6的水平。(6)免疫组化法检测NF-κB的蛋白表达水平。
结果：
1.一般情况比较：(1)与基线相比，NC组大鼠的体重随时间逐渐增加。与NC组相比，DS组和DF组大鼠的体重随时间增加不明显，在第6周、第8周和第12周时，DS和DF组大鼠的体重明显低于NC组(P＜0.05)；DS和DF组间未见明显差异。(2)与NC组相比，DS组和DF组大鼠的死亡率增加，但组间未见显著差异。
2.血糖波动情况比较：(1)DS和DF组大鼠的MBG、SDBG和LAGE水平与NC组相比显著增加；DF组的SDBG和LAGE水平显著高于DS组(P＜0.05)。(2)DS组和DF组HbA1c水平明显高于NC组(P＜0.01)，DS组和DF组间未见差异。
3.认知功能评估：(1)跳台实验结果显示，三组大鼠的学习能力比较，DS组和DF组大鼠的反应时间和错误次数均明显高于NC组。三组大鼠的记忆能力比较，DF组的记忆潜伏期最短，错误次数最多(P＜0.05)。(2)与NC组相比，DS组和DF组大鼠海马中p-Tau含量升高，DF组升高更显著(P＜0.05)；三组大鼠Tau蛋白表达无明显差异。(3)与NC组相比，DS组与DF组大鼠海马中p-GSK3β及p-Akt的表达水平显著下降，其中DF组的表达水平最低(P＜0.05)。
4．周围神经功能评估：(1)与NC组相比，坐骨神经的平均MNCV水平在DS组和DF组显著下降，与DS组相比，DF组下降更显著(P＜0.05)。(2)坐骨神经电镜结果显示，NC组神经髓鞘和轴索的结构清晰，线粒体结构完整；DS组神经髓鞘板层散乱，轴索内线粒体肿胀，结构模糊；DF组神经髓鞘高度弯曲，轴索内线粒体肿胀，部分出现溶解。(3)与NC组相比，DS组和DF组坐骨神经中ALCAT1的蛋白表达水平增加，其中DF组水平最高(P＜0.01)。(4)与NC组和DS组相比，DF组SOD的表达水平显著下降(P＜0.05)。与NC组相比，DS组和DF组坐骨神经中MDA的表达水平显著增加，DF组明显高于DS组(P＜0.05)。(5)与NC组相比，DS组和DF组坐骨神经中TNF-α、IL-6的表达水平显著上升，DF组明显高于DS组(P＜0.05)。(6)与NC组相比，DS组及DF组坐骨神经中NF-κB表达增多，DF组增加更显著(P＜0.05)。
结论：
1.血糖波动影响糖尿病大鼠的认知功能及海马组织Tau蛋白磷酸化，其机制可能与Akt/GSK3β信号通路有关。
2.血糖波动损伤糖尿病大鼠坐骨神经的髓鞘及线粒体超微结构，促进ALCAT1表达、氧化应激和炎症反应，其机制可能与NF-κB信号通路有关。
流行病学研究结果表明，随着糖尿病及糖尿病前期在全世界范围内的流行，糖尿病相关并发症也越来越多。糖尿病慢性并发症的发生发展不仅与血糖整体水平升高有关，而且与血糖波动(glucose variability，GV)密切相关。GV是指血糖水平在其高峰和低谷之间变化的不稳定状态。糖尿病患者常因胰岛功能下降和胰岛素抵抗，对血糖的调节能力变差。胰岛β细胞功能越差，GV的幅度越高。GV已是糖尿病慢性并发症的独立危险因素。糖尿病神经病变(diabetic neuropathy，DN)是糖尿病常见慢性并发症之一，随着病程进展，超过50%的患者可合并神经并发症，包括中枢神经病变及周围神经病变。
认知功能障碍是糖尿病中枢神经病变的常见临床表现类型，患者会出现学习、记忆及复杂的信息处理能力下降，严重者甚至痴呆。近年来有研究发现，GV是认知功能障碍和痴呆的危险因素，而具体机制尚不明确。Tau蛋白是广泛存在于神经元内的微管相关蛋白，与微管的组装及稳定性密切相关。海马中Tau蛋白过度磷酸化与神经细胞变性和认知功能障碍密切相关。动物模型中发现糖尿病大鼠的海马超微结构破坏明显，细胞内Tau蛋白过度磷酸化。GV是否通过增加海马中Tau蛋白磷酸化影响认知功能尚不清楚。研究发现，Akt/GSK3β信号通路参与了Tau蛋白的异常磷酸化。与单纯高血糖相比，GV是否通过Akt/GSK3β信号通路加重了海马组织内Tau蛋白磷酸化有待进一步研究。
除了认知功能障碍，众多研究发现GV与糖尿病周围神经病变(diabetic peripheral neuropathy, DPN)患者的临床严重程度有密切关系。线粒体功能紊乱、氧化应激及炎症反应参与DPN的发生发展。我们前期研究发现，糖尿病大鼠的坐骨神经线粒体中出现了心磷脂(cardiolipin，CL)的病态重构，其线粒体功能受损。研究发现，线粒体功能紊乱将导致活性氧自由基(reactive oxygen species, ROS)生成增多，机体氧化和抗氧化防御的平衡被打破，引起氧化应激反应并激活NF-κB等转录因子启动和放大神经元局部的炎症反应。与单纯高糖相比，GV是否会加重周围神经线粒体功能紊乱、氧化应激和炎症反应有待于进一步验证。
本实验通过构建血糖波动糖尿病大鼠模型，评价其认知功能、检测海马区域Tau蛋白的磷酸化水平及Akt/GSK3β信号的表达情况。其次，观察坐骨神经的超微结构和功能变化，明确坐骨神经中ALCAT1表达情况，评估坐骨神经中氧化应激指标丙二醛(malondialdehyde，MDA)和抗氧化应激指标超氧化物歧化酶(superoxyde dismutase，SOD)、炎症因子TNF-α、IL-6及其连接枢纽NF-κB表达水平。
目的：
1.观察血糖波动对糖尿病大鼠认知功能的影响。
2.评价血糖波动对糖尿病大鼠海马中Tau蛋白磷酸化的作用和Akt/GSK3β信号通路的影响，探讨血糖波动所致认知功能障碍的可能机制。
3.观察血糖波动糖尿病大鼠坐骨神经超微结构和功能的影响。
4.明确血糖波动对坐骨神经局部ALCAT1表达、氧化应激和炎症反应指标的作用。
方法：
1.糖尿病及血糖波动大鼠模型的建立：(1)8周龄的雄性SD大鼠随机化分为3组，对照组(NC组)、持续高糖组(DS组)和血糖波动组(DF组)。DS组和DF组给予腹腔内注射STZ诱导糖尿病模型，DF组大鼠每日在特定时间交替腹腔内注射50%葡萄糖液(2g/kg)及皮下注射普通胰岛素(20U/kg)构建血糖波动模型。给予DS组和NC组给予相同体积的生理盐水腹腔或皮下注射，共计12周。(2)每两周检测大鼠体重，每两周固定测一日内6点(6:30、9:30、12:30、15:30、18:30和21:30)血糖水平，计算各组大鼠的平均血糖(MBG)、血糖标准差(SDBG)及最大血糖波动幅度(LAGE)。(3)在实验第8周和第12周时测定糖化血红蛋白(HbA1c)。
2.实验第8周时对各组大鼠的认知功能进行评估：(1)应用跳台实验评价大鼠的认知功能：包括学习能力和记忆能力。(2)免疫组化法分析大鼠海马组织中磷酸化的Tau蛋白(p-Tau)及总的Tau蛋白(Tau)表达水平。(3)Westernblot法检测大鼠海马组织中GSK3β及Akt信号通路的变化。
3.实验第12周时对各组大鼠周围神经功能进行评估：(1)应用神经电生理检测大鼠坐骨神经的运动神经传导速度(motor nerve conduction velocity ， MNCV)。(2)应用电子显微镜观察大鼠坐骨神经的超微结构。(3)Westernblot法检测大鼠坐骨神经中ALCAT1的蛋白表达水平。(4)羟胺法测定SOD的活性，比色法测定大鼠坐骨神经中MDA的含量。(5)ELISA法检测坐骨神经中TNF-α和IL-6的水平。(6)免疫组化法检测NF-κB的蛋白表达水平。
结果：
1.一般情况比较：(1)与基线相比，NC组大鼠的体重随时间逐渐增加。与NC组相比，DS组和DF组大鼠的体重随时间增加不明显，在第6周、第8周和第12周时，DS和DF组大鼠的体重明显低于NC组(P＜0.05)；DS和DF组间未见明显差异。(2)与NC组相比，DS组和DF组大鼠的死亡率增加，但组间未见显著差异。
2.血糖波动情况比较：(1)DS和DF组大鼠的MBG、SDBG和LAGE水平与NC组相比显著增加；DF组的SDBG和LAGE水平显著高于DS组(P＜0.05)。(2)DS组和DF组HbA1c水平明显高于NC组(P＜0.01)，DS组和DF组间未见差异。
3.认知功能评估：(1)跳台实验结果显示，三组大鼠的学习能力比较，DS组和DF组大鼠的反应时间和错误次数均明显高于NC组。三组大鼠的记忆能力比较，DF组的记忆潜伏期最短，错误次数最多(P＜0.05)。(2)与NC组相比，DS组和DF组大鼠海马中p-Tau含量升高，DF组升高更显著(P＜0.05)；三组大鼠Tau蛋白表达无明显差异。(3)与NC组相比，DS组与DF组大鼠海马中p-GSK3β及p-Akt的表达水平显著下降，其中DF组的表达水平最低(P＜0.05)。
4．周围神经功能评估：(1)与NC组相比，坐骨神经的平均MNCV水平在DS组和DF组显著下降，与DS组相比，DF组下降更显著(P＜0.05)。(2)坐骨神经电镜结果显示，NC组神经髓鞘和轴索的结构清晰，线粒体结构完整；DS组神经髓鞘板层散乱，轴索内线粒体肿胀，结构模糊；DF组神经髓鞘高度弯曲，轴索内线粒体肿胀，部分出现溶解。(3)与NC组相比，DS组和DF组坐骨神经中ALCAT1的蛋白表达水平增加，其中DF组水平最高(P＜0.01)。(4)与NC组和DS组相比，DF组SOD的表达水平显著下降(P＜0.05)。与NC组相比，DS组和DF组坐骨神经中MDA的表达水平显著增加，DF组明显高于DS组(P＜0.05)。(5)与NC组相比，DS组和DF组坐骨神经中TNF-α、IL-6的表达水平显著上升，DF组明显高于DS组(P＜0.05)。(6)与NC组相比，DS组及DF组坐骨神经中NF-κB表达增多，DF组增加更显著(P＜0.05)。
结论：
1.血糖波动影响糖尿病大鼠的认知功能及海马组织Tau蛋白磷酸化，其机制可能与Akt/GSK3β信号通路有关。
2.血糖波动损伤糖尿病大鼠坐骨神经的髓鞘及线粒体超微结构，促进ALCAT1表达、氧化应激和炎症反应，其机制可能与NF-κB信号通路有关。