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【目的】
以体外培养肝星状(HSC-T6)细胞为材料，采用现代分子生物学的理论和技术，分析miRNA-146a和TGF-β1/Smad4信号通路的相关性，阐明miRNA-146a通过靶向调控Smad4表达抑制肝纤维化的分子机制；在此基础上，从miRNA-146a与TGF-β1/Smad4信号通路协同作用的角度研究加味四逆散防治肝纤维化机制。该研究将揭示加味四逆散通过miRNA-146a和TGF-β1/Smad4信号通路的协同作用抑制肝纤维化的分子机制，为加味四逆散用于临床治疗肝纤维化提供新的理论依据。
【方法】
1.建立细胞模型和含药血清的提取：
长势良好的HSC-T6细胞用完全培养基稀释后，接种于24孔板，每孔1.5*104个，贴壁后，分别转染阴性、miRNA-146a（过表达）和miRNA-146a-5p（沉默）的病毒，根据转染时间在荧光显微镜下观察转染效率，并用嘌呤酶素2.2ug/mL进行细胞筛选约10天左右，荧光率达到85-90%，用PCR法检测建立的细胞模型miRNA-146a表达水平。
将SPF级雄性SD大鼠（180-200g）分为加味四逆散组和空白组，用浓度为3.12g/ml的加味四逆散和生理盐水给大鼠2次/天灌胃3天，第四日灌胃1-2h后腹主动脉采血，静置2h后，3500r/分，30min，提取血清，放置-80℃保存。
2.miRNA-146a过表达和沉默的活化肝星状细胞（HSC-T6）细胞模型的生物学指标检测：
分为HSC-T6、HSC-T6阴性、miRNA-146a和miRNA-146a-5p四组细胞，生长48h后，MTT法检测细胞增殖率的影响，流式检测细胞凋亡率和周期的变化；应用RT-PCR和Westernblot法检测miRNA-146amRNA和Smad4、α-SMA、TGF-β1蛋白表达的变化。
3.加味四逆散干预细胞后对细胞的生物学行为的影响：
将细胞分为HSC-T6、HSC-T6阴性、miRNA-146a和miRNA-146a-5p四组，分别用加味四逆散高（原血清）、中（二倍稀释）、低浓度（四倍稀释）和空白血清组干预细胞后48h，采用MTT法和流式检测加味四逆散对细胞的抑制作用和凋亡影响。采用RT-PCR和Westernblot方法检测加味四逆散含药血清对细胞的miRNA-146amRNA表达和α-SMA、Smad4、TGF-β1蛋白表达的影响。
【结果】
1.在荧光显微镜下观察转染效率达到85-90%后，qPCR结果显示：miRNA-146a过表达组miRNA-146amRNA表达增加，miRNA-146a沉默组的HSC-T6细胞mRNA表达量下降。
2.miRNA-146a过表达组较阴性组和沉默组，在48h细胞增殖率显著降低（P＜0.05）。miRNA-146a过表达组较沉默组，miRNA-146a过表达时，HSC-T6细胞凋亡率显著增加；S期细胞比率下降。
3.miRNA-146a过表达时，HSC-T6细胞TGF-β1、Smad4、α-SMA蛋白表达显著降低；当miRNA-146a沉默时，HSC-T6细胞TGF-β1、Smad4、α-SMA表达显著提高(P＜0.05)。
4.加味四逆散对HSC-T6、HSC-T6阴性、miRNA-146a过表达和miRNA-146a沉默细胞的增殖速率具有浓度依赖性和时间依赖性。高浓度组的抑制率分别为：80.75%、49.27%、28.57%、49.94%，具有统计学意义（P＜0.05）。
5.加味四逆散组与空白血清组相比凋亡率有明显差异，且具有浓度依赖性，当miRNA-146a沉默时，中、低浓度组对细胞凋亡率无明显变化。
6.加味四逆散对HSC-T6细胞处理后，miRNA-146a沉默时，miRNA-146amRNA表达量无明显变化；而当miRNA-146a过表达时，miRNA-146amRNA表达量明显上调。
7.加味四逆散对HSC-T6处理后，当miRNA-146a过表达时，HSC-T6细胞α-SMA和Smad4蛋白表达显著降低，而miRNA-146a沉默时高浓度引起HSC-T6细胞α-SMA和TGF-β1蛋白表达显著降低，肝纤维化状态有部分改善。
【结论】
1.miRNA-146a靶向调节TGF-β1/Smad4信号通路调控HSC-T6细胞增殖和凋亡。
2.加味四逆散能够调节miRNA-146a与TGF-β1/Smad4信号通路，共同调控HSC-T6细胞增殖和凋亡，达到抗纤维化作用。
以体外培养肝星状(HSC-T6)细胞为材料，采用现代分子生物学的理论和技术，分析miRNA-146a和TGF-β1/Smad4信号通路的相关性，阐明miRNA-146a通过靶向调控Smad4表达抑制肝纤维化的分子机制；在此基础上，从miRNA-146a与TGF-β1/Smad4信号通路协同作用的角度研究加味四逆散防治肝纤维化机制。该研究将揭示加味四逆散通过miRNA-146a和TGF-β1/Smad4信号通路的协同作用抑制肝纤维化的分子机制，为加味四逆散用于临床治疗肝纤维化提供新的理论依据。
【方法】
1.建立细胞模型和含药血清的提取：
长势良好的HSC-T6细胞用完全培养基稀释后，接种于24孔板，每孔1.5*104个，贴壁后，分别转染阴性、miRNA-146a（过表达）和miRNA-146a-5p（沉默）的病毒，根据转染时间在荧光显微镜下观察转染效率，并用嘌呤酶素2.2ug/mL进行细胞筛选约10天左右，荧光率达到85-90%，用PCR法检测建立的细胞模型miRNA-146a表达水平。
将SPF级雄性SD大鼠（180-200g）分为加味四逆散组和空白组，用浓度为3.12g/ml的加味四逆散和生理盐水给大鼠2次/天灌胃3天，第四日灌胃1-2h后腹主动脉采血，静置2h后，3500r/分，30min，提取血清，放置-80℃保存。
2.miRNA-146a过表达和沉默的活化肝星状细胞（HSC-T6）细胞模型的生物学指标检测：
分为HSC-T6、HSC-T6阴性、miRNA-146a和miRNA-146a-5p四组细胞，生长48h后，MTT法检测细胞增殖率的影响，流式检测细胞凋亡率和周期的变化；应用RT-PCR和Westernblot法检测miRNA-146amRNA和Smad4、α-SMA、TGF-β1蛋白表达的变化。
3.加味四逆散干预细胞后对细胞的生物学行为的影响：
将细胞分为HSC-T6、HSC-T6阴性、miRNA-146a和miRNA-146a-5p四组，分别用加味四逆散高（原血清）、中（二倍稀释）、低浓度（四倍稀释）和空白血清组干预细胞后48h，采用MTT法和流式检测加味四逆散对细胞的抑制作用和凋亡影响。采用RT-PCR和Westernblot方法检测加味四逆散含药血清对细胞的miRNA-146amRNA表达和α-SMA、Smad4、TGF-β1蛋白表达的影响。
【结果】
1.在荧光显微镜下观察转染效率达到85-90%后，qPCR结果显示：miRNA-146a过表达组miRNA-146amRNA表达增加，miRNA-146a沉默组的HSC-T6细胞mRNA表达量下降。
2.miRNA-146a过表达组较阴性组和沉默组，在48h细胞增殖率显著降低（P＜0.05）。miRNA-146a过表达组较沉默组，miRNA-146a过表达时，HSC-T6细胞凋亡率显著增加；S期细胞比率下降。
3.miRNA-146a过表达时，HSC-T6细胞TGF-β1、Smad4、α-SMA蛋白表达显著降低；当miRNA-146a沉默时，HSC-T6细胞TGF-β1、Smad4、α-SMA表达显著提高(P＜0.05)。
4.加味四逆散对HSC-T6、HSC-T6阴性、miRNA-146a过表达和miRNA-146a沉默细胞的增殖速率具有浓度依赖性和时间依赖性。高浓度组的抑制率分别为：80.75%、49.27%、28.57%、49.94%，具有统计学意义（P＜0.05）。
5.加味四逆散组与空白血清组相比凋亡率有明显差异，且具有浓度依赖性，当miRNA-146a沉默时，中、低浓度组对细胞凋亡率无明显变化。
6.加味四逆散对HSC-T6细胞处理后，miRNA-146a沉默时，miRNA-146amRNA表达量无明显变化；而当miRNA-146a过表达时，miRNA-146amRNA表达量明显上调。
7.加味四逆散对HSC-T6处理后，当miRNA-146a过表达时，HSC-T6细胞α-SMA和Smad4蛋白表达显著降低，而miRNA-146a沉默时高浓度引起HSC-T6细胞α-SMA和TGF-β1蛋白表达显著降低，肝纤维化状态有部分改善。
【结论】
1.miRNA-146a靶向调节TGF-β1/Smad4信号通路调控HSC-T6细胞增殖和凋亡。
2.加味四逆散能够调节miRNA-146a与TGF-β1/Smad4信号通路，共同调控HSC-T6细胞增殖和凋亡，达到抗纤维化作用。