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T淋巴细胞作为获得性免疫系统的关键组分，被认为由造血干细胞(hematopoieticstem cells,HSCs)通过一个严格等级约束产生。在小鼠成年造血过程中，具有淋-髓系潜能的淋巴多能前体(lymphoid-primed multipotent progenitors, LMMPs)产生胸腺定居的前体(thymus-seeding progenitors, TSPs)。随后，TSPs定植到胸腺中，经过増殖、分化和成熟产生T细胞。虽然该过程被广泛的研究，但是在胚胎阶段介导造血前体细胞迀移到胸腺并分化产生T细胞的分子机制仍有待进一步探究。因此，本研究利用斑马鱼CDaniorerio)模型探索了早期T淋巴细胞形成的分子机制。
近三十年来，因为斑马鱼具有体外发育、胚胎透明和遗传操作简便等优势，被广泛用脊椎动物的造血系统研究。斑马鱼至少有两波造血，包括原始造血和永久造血。在大约受精后28小时(hours of post fertilization, hpf)斑马鱼的永久造血发生在背主动脉的腹侧壁(ventral wall of dorsal aorta, VDA )，造血干祖细胞(hematopoietic stem progenitor cells, HSPCs)或HSCs通过内皮向造血转化(endothelial hematopoietic transition,EHT)从主动脉生血内皮中产生。随后，VDA出生的造血前体细胞迀移到尾部造血组织(caudal hematopoietic tissue, CHT)进行特化和増殖，然后定居到胸腺分化产生T细胞。
在T淋巴细胞的形成过程中，白细胞介素、趋化因子、转录因子和Notch信号通路等參与造血前体细胞的迀移、増殖和分化。其中转录因子是最重要的细胞内源性决定因子之一。转录因子IKAROS家族锌指蛋白1(Ikzf1)，也称为Ikaros，最早在小鼠肝脏原基中被鉴定。Ikzf1基因产生由N末端DNA结合结构域和C末端蛋白质相互作用结构域构成的多种剪接异构体，并表达在多种造血细胞的亚群中，尤其在淋巴细胞中富集表达。正如研究所报道，携帯不同Ikzf1等位基因突变的小鼠，表现出严重的淋巴细胞缺陷。与在小鼠的研究结果相似，斑马鱼ikzf1等位基因的突变，表现出显著的早期T细胞发育缺陷，表明Ikzf1的功能在进化上是保守的。尽管Ikzf1的相关功能进行了数十年广泛的研究，但对胚胎T淋巴细胞生成的分子机制尚不清楚。
为了探索Ikzf1在胚胎T淋巴细胞形成过程中的功能，通过荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)和定量PCR(quantitative PCR, qPCR)实验，我们发现ikzf1表达在多种血液细胞中，尤其在HSPCs和T淋巴细胞中高度富集，预示着Ikzf1參与斑马鱼胚胎T淋巴细胞形成的多个阶段。因此，我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了两种不同功能结构域缺失的ikzf1突变体。全胚整体原位杂交(whole mount in situ hybridization, WISH)的结果发现Ikzf1功能的缺失导致胸腺中T细胞的丧失。此外，ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体表现很高的死亡率，很少能够活过6月，且成年ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体T淋巴细胞仍然发育缺陷。由于这两种突变体的表型一致，我们后面主要用ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体进行研究。
为了探究在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中造成胚胎期T细胞缺失的原因，在36hpf我们发现ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中HSPCs在VDA区域的产生是正常的。然而，大约在60hpf,ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中HSPCs向胸腺归巢发生障碍，与此同时在突变体和siblings的CHT中HSPCs并没有发生改变。为了进一步确认ikfΔ4+3/Δ4+3突变体中HSPCs胸腺归巢的缺陷，我们利用转基因系Tg(coro1a: DsRed;lyz: GFP)、Tg(coro1a: Kaede)和Tg(kdrl: Dendra2),分别对造血前体的胸腺归巢进行活体实时成像和瞬时谱系追踪。与野生型(wildtype,WT)相比，活体实时成像结果显示在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中从60-72hpf没有coro1a-DsRed+/lyz-GFP_造血前体细胞定居到胸腺。通过Tg(coro1a:K aede)和Tg(kdrl:D endra2)转基因背景，在受精后2天(days of post fertilization, dpf)分别在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体和野生型标记CHT区域的Kaede+细胞和VDA区域的Dendra2+细胞，实验结果表明在3dpf没有被标记的造血前体细胞进入突变体的胸腺。这些结果掲示Ikzf1对HSPCs的胸腺归巢是必不可少的。
在ikzf1M+3細突变体的肾脏中定居的coro1a-Kaede+细胞減少，暗示HSPCs库在之后的发育过程中可能不能被維持。为了检验这个猜想，通过WISH、流式细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, F A C S )、TUNEL染色和EdU染色等实验，我们发现在ikzf1w+3突变体的尾部造血组织HSPCs的数目显著減少，HSPCs细胞周期相关基因的表达下调以及HSPCs库中的EdU+细胞比例降低，但是HSPCs凋亡水平在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体和野生型中没有明显变化，说明Ikzf1对尾部造血组织的造血干祖细胞的增殖非常重要。因此，HSPCs维持缺陷也是造成ikzf，3細突变体T细胞缺失的原因之一。
之前研究表明，在斑马鱼和小鼠中，趋化因子通路Ccl25-Ccr9參与调控造血前体细胞定植到胸腺。为了验证趋化因子信号是否介导ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中造血前体细胞的胸腺归巢，我们检测了与小鼠中造血前体细胞表达的Ccr9直系同源基因ccr9a。WISH结果显示，与对照相比，ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体胚胎的CHT无法检测到ccr9a信号。通过ChIP-qPCR(chromatin immunoprecipitation-qPCR)和双焚光报告分析(dual-luciferase reporter analysis)实验，结果证明ccr9a是Ikzf1的直接靶基因。为了验证Ccr9a的功能，我们利用CRISPR-Cas9系统获得Ccr9a功能缺失的突变体。并且，在ccr9aΔ10/Δ10突变斑马鱼中，我们发现胸腺中T细胞減少，但是造血前体细胞的产生和増殖在尾部造血组织没有受到影响。同样地，活体实时成像和瞬时谱系追踪结果表明ccr9aΔ10/Δ10突变体T细胞发育缺陷是由于造血前体细胞不能有效地迀移到胸腺导致的。
为了进一步确认Ccr9a介导造血前体细胞的胸腺归巢，我们在ikzf1Δ4+3/Δ4+3变体中回补其表达并分析T细胞的表型。我们构建了在白细胞和造血前体细胞中稳定表达ccr9a的Tg(coro1a: ccr9a)转基因系。实验结果发现，表达CD41和cmyb而不表达mpl分子标记的造血前体迀移到ikzf1Δ4+3/Δ4+3;Tg(coro1a: ccr9a)突变体的胸腺。然而，这些造血前体不能分化产生rag1+和tcrb+T细胞。因此，Ccr9a在造血前体细胞迀移到胸腺中扮演重要作用，但是在分化过程中作用有限。这些结果表明T细胞的分化还需要其他因子參与。
IRF4是小鼠中干扰素调控因子家族中的成员，对CD4+T和CD8+T细胞亚群的分化非常重要。最近在斑马鱼中的研究表明，Irf4通过拮抗pu」的表达抑制HSPCs向髓系命运的选择，从而决定淋系的分化潜能。与ccr9a表达情况相似，我们发现在认Δ4+3/Δ4+3突变体中几乎检测不到irf4a的表达。同样地，通过ChlP-qPCR和双荧光报告系统，结果证明irf4a是Ikzf1另一个直接调控的靶基因。为了进一步分析Irf4的功能，我们利用基因编辑技术TALENs构建了irf4aA18/A18突变体。结果发现Irf4缺陷造成T淋巴细胞減少，但是在irf4aぷ％118突变体和siblings中的造血前体细胞产生和増殖都是正常的。并且，利用活体成像和瞬时谱系追踪技木，与在ikz/IM+3/M+3和ccWa^—突变体中观察的结果类似，造血前体细胞归巢到胸腺受损导致T细胞在irf4aA18/A18突变体中減少。
为了证明Irf4a是否能够拯救认Δ4+3/Δ4+3突变体中T淋巴细胞缺失的表型，我们构建了Tg(coro1a: irf4a)转基因系。实验结果发现回补irf4a能够拯救ikzΔ4+3/Δ4+3突变体尾部造血组织中造血前体细胞的増殖和T细胞相关基因的表达。而且，我们发现ikzf1Δ4+3/Δ4+3;Tg(coro1a: irf4a; coro1a: ccr9a)突变体胸腺中T淋巴细胞的发育部分恢复，比在ikzf1Δ4+3/Δ4+3;Tg(coro1a: irf4 a )突变体的恢复效率更高。这些结果表明Irf4a的功能对造血前体细胞的増殖和分化是十分重要的。此外，我们发现Irf4a拯救的T淋巴细胞部分依赖于ccr9a的表达，并且通过免疫共沉淀和双荧光报告分析实验，发现Ikzf1和Irf4a存在相互作用并能够调控ccr9a启动子的活性，预示着Ikzf1和Irf4a可能以转录复合物促进ccr9a的表达。
综上所迷，利用斑马鱼胚胎发育和遗传操作的优势，我们探究了Ikzf1、Irf4a和Ccr9a在斑马鱼的胚胎的T淋巴细胞形成过程中的作用。我们的研究发现，Ikzf1在胚胎T淋巴细胞形成的多个阶段起到重要的作用，包括调控HSPCs的増殖、胸腺归巢和T细胞分化。通过构建多种突变体和过表达转基因系，我们发现Ikzf1功能丧失表现出在CHT的HSPCs增殖发生障碍，HSPCs向胸腺迀移发生缺陷，胸腺中的T细胞分化被阻断，导致胚胎期T淋巴细胞在胸腺不能形成。在机制上，我们鉴定到Ikzf1通过下游的靶基因—ccr9a，调控HSPCs向胸腺的归巢。并且在CHT区域的HSPCs增殖和胸腺归巢的HSPCs分化依赖于Ikzf1的另一个勒基因---irf4a。此外，在遗传调控网络中，ccr9a的表达可以被Ikzf1和Irf4a形成的转录复合体调控。总之，在T淋巴细胞形成过程中，Ikzf1启动irf4a表达，决定造血前体细胞淋系的命运和促进造血前体细胞的増殖，然后Ikzf1和Irf4a形成转录复合体调控下游相关基因，如ccr9a,的表达以引导HSPCs向胸腺迀移，并促进HSPCs在胸腺分化产生T细胞。我们的研究为理解胚胎阶段T淋巴细胞形成的遗传调控网络提供了新的见解。
近三十年来，因为斑马鱼具有体外发育、胚胎透明和遗传操作简便等优势，被广泛用脊椎动物的造血系统研究。斑马鱼至少有两波造血，包括原始造血和永久造血。在大约受精后28小时(hours of post fertilization, hpf)斑马鱼的永久造血发生在背主动脉的腹侧壁(ventral wall of dorsal aorta, VDA )，造血干祖细胞(hematopoietic stem progenitor cells, HSPCs)或HSCs通过内皮向造血转化(endothelial hematopoietic transition,EHT)从主动脉生血内皮中产生。随后，VDA出生的造血前体细胞迀移到尾部造血组织(caudal hematopoietic tissue, CHT)进行特化和増殖，然后定居到胸腺分化产生T细胞。
在T淋巴细胞的形成过程中，白细胞介素、趋化因子、转录因子和Notch信号通路等參与造血前体细胞的迀移、増殖和分化。其中转录因子是最重要的细胞内源性决定因子之一。转录因子IKAROS家族锌指蛋白1(Ikzf1)，也称为Ikaros，最早在小鼠肝脏原基中被鉴定。Ikzf1基因产生由N末端DNA结合结构域和C末端蛋白质相互作用结构域构成的多种剪接异构体，并表达在多种造血细胞的亚群中，尤其在淋巴细胞中富集表达。正如研究所报道，携帯不同Ikzf1等位基因突变的小鼠，表现出严重的淋巴细胞缺陷。与在小鼠的研究结果相似，斑马鱼ikzf1等位基因的突变，表现出显著的早期T细胞发育缺陷，表明Ikzf1的功能在进化上是保守的。尽管Ikzf1的相关功能进行了数十年广泛的研究，但对胚胎T淋巴细胞生成的分子机制尚不清楚。
为了探索Ikzf1在胚胎T淋巴细胞形成过程中的功能，通过荧光原位杂交(Fluorescence in situ hybridization, FISH)和定量PCR(quantitative PCR, qPCR)实验，我们发现ikzf1表达在多种血液细胞中，尤其在HSPCs和T淋巴细胞中高度富集，预示着Ikzf1參与斑马鱼胚胎T淋巴细胞形成的多个阶段。因此，我们利用CRISPR-Cas9基因编辑技术，构建了两种不同功能结构域缺失的ikzf1突变体。全胚整体原位杂交(whole mount in situ hybridization, WISH)的结果发现Ikzf1功能的缺失导致胸腺中T细胞的丧失。此外，ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体表现很高的死亡率，很少能够活过6月，且成年ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体T淋巴细胞仍然发育缺陷。由于这两种突变体的表型一致，我们后面主要用ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体进行研究。
为了探究在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中造成胚胎期T细胞缺失的原因，在36hpf我们发现ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中HSPCs在VDA区域的产生是正常的。然而，大约在60hpf,ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中HSPCs向胸腺归巢发生障碍，与此同时在突变体和siblings的CHT中HSPCs并没有发生改变。为了进一步确认ikfΔ4+3/Δ4+3突变体中HSPCs胸腺归巢的缺陷，我们利用转基因系Tg(coro1a: DsRed;lyz: GFP)、Tg(coro1a: Kaede)和Tg(kdrl: Dendra2),分别对造血前体的胸腺归巢进行活体实时成像和瞬时谱系追踪。与野生型(wildtype,WT)相比，活体实时成像结果显示在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中从60-72hpf没有coro1a-DsRed+/lyz-GFP_造血前体细胞定居到胸腺。通过Tg(coro1a:K aede)和Tg(kdrl:D endra2)转基因背景，在受精后2天(days of post fertilization, dpf)分别在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体和野生型标记CHT区域的Kaede+细胞和VDA区域的Dendra2+细胞，实验结果表明在3dpf没有被标记的造血前体细胞进入突变体的胸腺。这些结果掲示Ikzf1对HSPCs的胸腺归巢是必不可少的。
在ikzf1M+3細突变体的肾脏中定居的coro1a-Kaede+细胞減少，暗示HSPCs库在之后的发育过程中可能不能被維持。为了检验这个猜想，通过WISH、流式细胞分选(fluorescence-activated cell sorting, F A C S )、TUNEL染色和EdU染色等实验，我们发现在ikzf1w+3突变体的尾部造血组织HSPCs的数目显著減少，HSPCs细胞周期相关基因的表达下调以及HSPCs库中的EdU+细胞比例降低，但是HSPCs凋亡水平在ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体和野生型中没有明显变化，说明Ikzf1对尾部造血组织的造血干祖细胞的增殖非常重要。因此，HSPCs维持缺陷也是造成ikzf，3細突变体T细胞缺失的原因之一。
之前研究表明，在斑马鱼和小鼠中，趋化因子通路Ccl25-Ccr9參与调控造血前体细胞定植到胸腺。为了验证趋化因子信号是否介导ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体中造血前体细胞的胸腺归巢，我们检测了与小鼠中造血前体细胞表达的Ccr9直系同源基因ccr9a。WISH结果显示，与对照相比，ikzf1Δ4+3/Δ4+3突变体胚胎的CHT无法检测到ccr9a信号。通过ChIP-qPCR(chromatin immunoprecipitation-qPCR)和双焚光报告分析(dual-luciferase reporter analysis)实验，结果证明ccr9a是Ikzf1的直接靶基因。为了验证Ccr9a的功能，我们利用CRISPR-Cas9系统获得Ccr9a功能缺失的突变体。并且，在ccr9aΔ10/Δ10突变斑马鱼中，我们发现胸腺中T细胞減少，但是造血前体细胞的产生和増殖在尾部造血组织没有受到影响。同样地，活体实时成像和瞬时谱系追踪结果表明ccr9aΔ10/Δ10突变体T细胞发育缺陷是由于造血前体细胞不能有效地迀移到胸腺导致的。
为了进一步确认Ccr9a介导造血前体细胞的胸腺归巢，我们在ikzf1Δ4+3/Δ4+3变体中回补其表达并分析T细胞的表型。我们构建了在白细胞和造血前体细胞中稳定表达ccr9a的Tg(coro1a: ccr9a)转基因系。实验结果发现，表达CD41和cmyb而不表达mpl分子标记的造血前体迀移到ikzf1Δ4+3/Δ4+3;Tg(coro1a: ccr9a)突变体的胸腺。然而，这些造血前体不能分化产生rag1+和tcrb+T细胞。因此，Ccr9a在造血前体细胞迀移到胸腺中扮演重要作用，但是在分化过程中作用有限。这些结果表明T细胞的分化还需要其他因子參与。
IRF4是小鼠中干扰素调控因子家族中的成员，对CD4+T和CD8+T细胞亚群的分化非常重要。最近在斑马鱼中的研究表明，Irf4通过拮抗pu」的表达抑制HSPCs向髓系命运的选择，从而决定淋系的分化潜能。与ccr9a表达情况相似，我们发现在认Δ4+3/Δ4+3突变体中几乎检测不到irf4a的表达。同样地，通过ChlP-qPCR和双荧光报告系统，结果证明irf4a是Ikzf1另一个直接调控的靶基因。为了进一步分析Irf4的功能，我们利用基因编辑技术TALENs构建了irf4aA18/A18突变体。结果发现Irf4缺陷造成T淋巴细胞減少，但是在irf4aぷ％118突变体和siblings中的造血前体细胞产生和増殖都是正常的。并且，利用活体成像和瞬时谱系追踪技木，与在ikz/IM+3/M+3和ccWa^—突变体中观察的结果类似，造血前体细胞归巢到胸腺受损导致T细胞在irf4aA18/A18突变体中減少。
为了证明Irf4a是否能够拯救认Δ4+3/Δ4+3突变体中T淋巴细胞缺失的表型，我们构建了Tg(coro1a: irf4a)转基因系。实验结果发现回补irf4a能够拯救ikzΔ4+3/Δ4+3突变体尾部造血组织中造血前体细胞的増殖和T细胞相关基因的表达。而且，我们发现ikzf1Δ4+3/Δ4+3;Tg(coro1a: irf4a; coro1a: ccr9a)突变体胸腺中T淋巴细胞的发育部分恢复，比在ikzf1Δ4+3/Δ4+3;Tg(coro1a: irf4 a )突变体的恢复效率更高。这些结果表明Irf4a的功能对造血前体细胞的増殖和分化是十分重要的。此外，我们发现Irf4a拯救的T淋巴细胞部分依赖于ccr9a的表达，并且通过免疫共沉淀和双荧光报告分析实验，发现Ikzf1和Irf4a存在相互作用并能够调控ccr9a启动子的活性，预示着Ikzf1和Irf4a可能以转录复合物促进ccr9a的表达。
综上所迷，利用斑马鱼胚胎发育和遗传操作的优势，我们探究了Ikzf1、Irf4a和Ccr9a在斑马鱼的胚胎的T淋巴细胞形成过程中的作用。我们的研究发现，Ikzf1在胚胎T淋巴细胞形成的多个阶段起到重要的作用，包括调控HSPCs的増殖、胸腺归巢和T细胞分化。通过构建多种突变体和过表达转基因系，我们发现Ikzf1功能丧失表现出在CHT的HSPCs增殖发生障碍，HSPCs向胸腺迀移发生缺陷，胸腺中的T细胞分化被阻断，导致胚胎期T淋巴细胞在胸腺不能形成。在机制上，我们鉴定到Ikzf1通过下游的靶基因—ccr9a，调控HSPCs向胸腺的归巢。并且在CHT区域的HSPCs增殖和胸腺归巢的HSPCs分化依赖于Ikzf1的另一个勒基因---irf4a。此外，在遗传调控网络中，ccr9a的表达可以被Ikzf1和Irf4a形成的转录复合体调控。总之，在T淋巴细胞形成过程中，Ikzf1启动irf4a表达，决定造血前体细胞淋系的命运和促进造血前体细胞的増殖，然后Ikzf1和Irf4a形成转录复合体调控下游相关基因，如ccr9a,的表达以引导HSPCs向胸腺迀移，并促进HSPCs在胸腺分化产生T细胞。我们的研究为理解胚胎阶段T淋巴细胞形成的遗传调控网络提供了新的见解。