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目的：除癌基因的激活和抑癌基因的失活外，细胞周期调控机制的紊乱，导致细胞无限制地增殖，也是恶性肿瘤发生的主要机制之一。细胞周期调控由一系列调控因子完成，其中细胞周期蛋白(cyclin)、细胞周期蛋白依懒性激酶(cyclin-dependent kinase，CDK)、细胞周期蛋白依赖性激酶抑制剂(cyclin-dependent kinase inhibitors,CDKI)在细胞周期调控中发挥重要作用。泛素依赖性蛋白水解途径是真核细胞中的一种重要的蛋白降解途径，对维持正常细胞功能具有非常重要的意义。S期激酶相关蛋白2(S-phase kinase associated protein 2，Skp2)作为SCF泛素蛋白的连接酶复合物的F-box底物识别亚单位，通过靶向作用于许多细胞周期调控蛋白的泛素介导的降解作用从而调节细胞周期。Skp2作为细胞周期中重要的调节因子，能特异性识别磷酸化底物并介导其泛素化降解，许多细胞周期调控因子如p27kip1、p21、p53、cyclinA、cyclinD1、cyclinE等都是泛素蛋白酶体途径底物。近年来研究表明Skp2有癌基因的潜能，在人类多种实体恶性肿瘤中高表达如胃癌、前列腺癌、口腔鳞癌、卵巢癌、大肠癌等等。而在人类血液系统恶性肿瘤白血病中的研究尚少，本研究旨在检测Skp2、p27kip1 mRNA在急性白血病中的表达并分析其临床意义。
方法：研究对象为白血病K562细胞株及125例急性白血病(AL)患者(其中包括93例初治患者、16例复发患者和16例持续完全缓解期患者)，18名健康人做正常对照。应用荧光实时定量PCR方法检测白血病细胞株及骨髓单个核细胞Skp2、p27kip1、cyclinE mRNA表达水平。
结果：1 Skp2 mRNA的表达：在白血病细胞株K562中Skp2 mRNA高表达，表达水平为(0.4271±0.1826)。在AL患者中，93例初治组患者表达水平为(0.3587±0.1872)；16例复发组患者中，表达水平为(0.4115±0.2154)；16例缓解组患者表达水平为(0.0370±0.0166)；而用同一实验条件检测18名正常人的表达水平为(0.0431±0.1201)。初治组和复发组表达水平明显高于缓解组和正常对照组(P＜0.05)；其中初治组和复发组表达水平比较没有统计学意义(P＞0.05)，缓解组和对照组比较没有统计学意义(P＞0.05)。以大于18例正常人Skp2 mRNA相对表达水平的95％可信区间的上限(0.2832)为高表达，低于上限为低表达。对93例初治AL患者进行临床疗效评估，65例获得CR，CR率为69.9％。其中Skp2 mRNA高表达的AL患者其CR58.3％(35/60)明显低于Skp2低表达者的CR率90.9％(30/33)，(x2=10.737，P＜0.05)，有统计学意义。对缓解的65例患者追踪随访15个月，其中13例失访，52例可进行临床评估，持续缓解1年以上40例，复发12例。在12例复发患者中10例Skp2 mRNA高表达，高表达组的复发率(16.7％，10/60)高于低表达组的复发率(6.1％,2/33)，卡方分析(X2=1.292，P＞0.05)，差别没有统计学意义。这可能与观察时间较短，复发例数少有关系，尚需进一步随访观察。持续缓解40例患者中，Skp2高表达者为12例，低表达者为28例，Skp2高表达组的持续缓解率20.0％(12/60)，低于Skp2低表达组的持续缓解率84.8％(28/33)，卡方分析(χ2=36.527，P＜0.05)，差别有统计学意义。2 p27kip1mRNA表达：在白血病细胞株K562中p27kip1mRNA表达水平为(0.0726±0.0163)。在AL患者中，93例初治组患者表达水平为(0.0681±0.0402)；16例复发组患者表达水平为(0.0768±0.0358)；16例缓解组患者表达水平为(0.3831±0.1623)；而用同一实验条件下18名正常人表达水平为(0.2638±0.0904)。初治组和复发组表达水平明显低于缓解组和正常对照组(P＜0.05)；其中初治组和复发组表达水平比较没有统计学意义(P＞0.05)，缓解组和对照组比较没有统计学意义(P＞0.05)。以大于18例正常人p27kip1mRNA相对表达水平的95％可信区间的下限(0.0830)为高表达，低于下限为低表达。对93例初治白血病患者进行疗效评估，其中65例获得CR，CR率为69.9％，其中p27kiP1mRNA高表达的AL患者其CR率86.7％(26/30)，明显高于p27kip1低表达者的CR率61.9％(39/63)，(x2=5.922，P＜0.05)，有统计学意义。对缓解的65例患者追踪随访15个月，其中失访13例，52例可进行临床评估，持续缓解1年以上40例，复发12例。在12例复发患者中3例p27kip1mRNA为高表达，高表达组的复发率为(10.0％，3/30)低于低表达组的复发率(14.3％，9/63)，卡方分析(x2=0.060，P＞0.05)，差别没有统计学意义，这可能与观察时间较短，复发例数少有关系，尚需进一步随访观察。在持续缓解的40例患者中，p27kip1 tuRNA高表达者22例，低表达者18例，高表达者持续缓解率为73.3％(22/30)，低表达者持续缓解率为28.6％(18/63)，卡方分析(X2=16.612，P＜0.05)有统计学意义。 3 cyclinE mRNA的表达：在白血病细胞株K562中cyclinEmRNA高表达，表达水平为(0.2736±0.1135)。本实验同时检测了cyclinE mRNA在白血病中表达，93例初治组的表达水平为(0.2675±0.1617)，16例复发患者的表达水平为(0.2726±0.1016)，16例缓解组患者表达水平为(0.0541±0.0253)，18名正常人表达水平为(0.0582±0.0630)初治组和复发组的表达水平明显高于缓解组和正常对照组(P＜0.05)；其中初治组和复发组表达水平比较没有统计学意义(P＞0.05)，缓解组和对照组比较没有统计学意义(P＞0.05)。以大于18例正常人cyclinE mRNA相对表达水平的95％可信区间的上限(0.1843)为高表达，低于上限为低表达。对93例初治白血病患者进行疗效评估，其中65例获得CR，CR率为69.9％。其中cyclinE mRNA低表达的AL患者其CR率83.3％(30/36)，明显高于cyclinE mRNA高表达者的CR率61.4％(35/57)，卡方分析(x2=5.043，P＜0.05)，有统计学意义。4在所同时检测125例AL患者中，用pearson相关分析发现Skp2与p27kip1 mRNA之间呈负相关性(r=-0.342，P=0.000)。Skp2与cyclinEmRNA之间呈正相关关系(r=0.463P=0.000)。cyclinE与p27kiP1之间呈负相关关系(r=-0.305，P=0.001)。我们同时检测了30例Skp2与cyclinE mRNA同时高表达的AL缓解率为46.7％(14/30)，22例同时低表达的AL缓解率为86.4％(19/22)。两者同时高表达的缓解率明显低于同时低表达的缓解率，且差别有统计学意义(x2=8.626，P＜0.05)。 5 Skp2、p27kip1 mRNA的表达水平与AL患者临床一般资料之间的关系。在性别、年龄、白细胞计数之间和表达水平无显著性差异(P＞0.05)；M2、M3、M4、M5、L1、L2各亚型间Skp2表达水平有差别，但各亚型间差别无统计学意义(P值均大于0.05)。p27kip1 mRNA在各亚型间差别无统计学意义(P值均大于0.05)。
结论：
1.Skp2在白血病细胞株K562及AL患者初治组和复发组中的mRNA表达水平明显高于持续缓解组和正常对照组。高表达的AL患者缓解率低，易复发，治疗效果差。提示Skp2参与AL的发生与发展，Skp2高表达是AL预后不良指标。
2.p27kip1在白血病细胞株。K562及AL患者初治组和复发组中的mRNA表达水平明显低于持续缓解组和正常对照组。p27kip1低表达的AL治疗效果差，复发率较高。p27kip1表达低下或缺失是AL预后不良指标。
3.cyclinE在白血病细胞株K562及AL患者初治组与复发组中的mRNA表达水平明显高于持续缓解组和正常对照组，且cyclinE高表达的患者缓解率低于低表达的患者。提示cyclinE参与AL的发生与发展，其高表达是AL预后不良指标。
4在AL患者中，Skp2与p27kip1呈负相关关系。高表达Skp2同时伴有p27kip1低表达的缓解率低，复发率高，预后差；而Skp2低表达同时伴有p27kip1高表达的缓解率高，复发率低，预后较好。在白血病发病机制中Skp2高表达促进p27kip1蛋白降解，而p27kip1 是cyclinD1-CDK2、cyclinE-CDK2复合物的抑制剂，尤其cyclinE-CDK2是促使细胞通过G1/S限制点的关键酶。p27kip1降解导致表达低下或缺失，对上述复合物的抑制作用减弱或缺失，从而使细胞周期调节紊乱，细胞无限增殖，形成恶性克隆，导致肿瘤生成。在急性白血病中Skp2、cyclin E同时高表达的患者，缓解率低，预后差。提示两者在白血病发病机制中起协同作用。两者联合检测可以指导白血病的治疗和判断评估预后。