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研究背景及目的: 鼻咽癌是我国常见的恶性肿瘤之一，尤其以华南地区发病率最高。现对于鼻咽癌的标准治疗是以放疗和铂类为基础化疗的联合运用。然而，部分患者经标准治疗达完全缓解后出现肿瘤复发，及部分初诊时为病程晚期的患者，因对化疗原发性耐药及放疗抵抗导致预后较差。对此，研究人员提出肿瘤干细胞这一假说，认为肿瘤干细胞就是导致恶性肿瘤发生、复发转移及放化疗抵抗的主要原因[1]。 肿瘤干细胞（Cancer stem cells，CSCs)假说认为，在肿瘤细胞当中存在一小部分具有自我更新的、无限增殖和分化潜能的细胞群，这一细胞群对肿瘤放化疗失败是导致肿瘤发生转移、复发的关键，而这一小部分细胞群则被称为肿瘤干细胞。这部分细胞具有形成并维持肿瘤生长和异质性的能力。因此，肿瘤的根治性策略应是寻找对肿瘤干细胞有特异性杀伤作用的分子。 目前被证明对肿瘤干细胞具有特异性抑制作用的生物活性物质越来越多，比如盐霉素，酪氨酸激酶抑制剂Afatinib[2]，小分子物质MS-209（Dofequidar fumarate）[3]。同时，现国内外众多研究表明，香茶菜属对映-贝壳杉烷类二萜化合物显著具有抗肿瘤和抗炎的作用。既往的研究表明，对映-贝壳杉烷类二萜化合物Longikaurin A（LK-A）可通过诱导细胞凋亡抑制鼻咽癌细胞株的增殖和激活线粒体信号通路诱导鼻咽癌细胞凋亡。低浓度的 LK-A可显著抑制鼻咽癌细胞株克隆形成能力。同时，LK-A可以显著抑制裸鼠皮下移植瘤的生长[4]。因此，我们猜测LK-A对鼻咽癌细胞的干性有抑制作用。就此，本论文拟研究Longikaurin A（LK-A）对鼻咽癌肿瘤干细胞的抑制作用进行了初步研究。 若可联合应用常规抗肿瘤手段和针对肿瘤干细胞的治疗，对肿瘤的生长和转移可以起到更好的抑制作用。众所周知，鼻咽癌常规抗肿瘤手段包括放射治疗和化学治疗，而且顺铂属于鼻咽癌标准化疗方案中重要组成之一，因此，本论文继续对Longikaurin A（LK-A）是否能增强顺铂对鼻咽癌细胞增殖抑制作用，亦能否对放射治疗起增敏甚至逆转鼻咽癌细胞对放射的抵抗特性进行了进一步探讨。 研究方法: 肿瘤球囊形成实验评价 LK-A对鼻咽癌干细胞自我更新能力的影响；流式细胞术实验评价LK-A对鼻咽癌细胞中SP细胞比例的作用；Western blotting法检测LK-A对细胞中c-myc和fibronectin蛋白表达水平的影响；MTT法测定药物的细胞毒作用，同时用来评价 LK-A和顺铂对于鼻咽癌细胞株联合作用效果；通过克隆形成实验从而拟合细胞剂量-存活曲线，用来评价LK-A对于鼻咽癌细胞株的放射增敏作用及逆转放射抗拒细胞株对放射抗拒作用。 结果 1．LK-A可有效降低鼻咽癌细胞肿瘤球囊的形成能力。鼻咽癌细胞株加入不同浓度的LK-A，培养7天后，其肿瘤球囊形成的数量及大小均呈浓度依赖性的减少。对形成的肿瘤球囊机械性吹散后重新计数，继续培养，可发现不同浓度处理的细胞二次肿瘤球囊形成数量及大小仍呈浓度依赖性降低。 2．LK-A浓度依赖性的降低鼻咽癌细胞中侧群细胞比例。随着 LK-A浓度升高,S18细胞的SP细胞比例由正常值38.23％下降至9.10%。而由于正常S26细胞株的SP细胞比例仅为1.42%，在不同浓度LK-A干预后，SP细胞比例下降最低至0.47%。 3．1μM的LK-A可显著增加顺铂对鼻咽癌细胞株S18，S26，5-8F的增殖抑制能力。在1μM LK-A干预下，顺铂对于鼻咽癌细胞株S18，S26，5-8F的IC50值分别从10.10±1.0μM、11.45±1.06μM、8.0±0.9μM下降至7.0±0.85μM、7.12±0.85μM、2.65±0.42μM。利用金正平均法检测两药联合作用Q值，6.0μM LK-A与1μg/ml的顺铂对于S18，S26，5-8F细胞株的Q值分别为1.04，0.86，1.02。8μM LK-A与1μg/ml的顺铂对于S18，S26，5-8F细胞株的Q值分别为0.97，0.91，0.87。 4．0.4μM的LK-A可增强鼻咽癌细胞株SUNE2对放射线的敏感度，同时可逆转SUNE2-IR细胞株的放射抗拒特性。通过克隆形成实验可见SUNE2、SUN2-IR细胞株在0.4μM LK-A干预下克隆数目形成无差别，但随射线照射剂量增加，LK-A干预组明显克隆形成较对照组少。剂量存活曲线 LK-A干预组较对照组也明显左移。LK-A对于SUNE2放射增敏比为1.16，对于SUNE2-IR的放射增敏比为1.14。 5．经含不同浓度的LK-A培养48h后，经western blot检测鼻咽细胞株中c-myc和fibronectin的蛋白表达水平显著下调。SUNE2-IR细胞株fibronectin蛋白水平表达较 SUNE2明显上调。LK-A可能通过下调 c-myc抑制鼻咽癌细胞的干性及下调fibronectin增强鼻咽癌细胞株的放射敏感性。 结论: LK-A可抑制鼻咽癌细胞的干性，同时对鼻咽癌细胞具有放化疗增敏及逆转放射抗拒作用。