外源性TGF-β及IGF-1诱导大鼠脂肪干细胞向软骨细胞分化的实验研究

• 作 者: 王勇
• 机 构: 中国医科大学
• 出 处: 中国医科大学
• 发表日期: 2008年9期
• 关键词: 关节软骨

关节软骨的损伤修复已成为近年来骨科临床基础研究的一个重要课题，关节软骨的损伤修复包括关节软骨、软骨细胞、骨膜和软骨膜的移植，软骨下骨钻孔或磨造，凝胶或纤维的植入，药物修复法，基因治疗及组织工程软骨等。在软骨组织工程研究中，种子细胞始终是一个至关重要的问题。最近的研究提示，在脂肪组织中也存在一种多能基质干细胞，具备向脂肪细胞、成骨细胞、软骨细胞、成肌细胞和神经细胞分化的能力，其取材容易，损伤较小，生物学性状稳定，可长期增殖，这种细胞有可能替代MSCs，成为新的组织工程的种子细胞来源。ADSCs同MSCs一样具有多向分化潜能，在适当的诱导条件下可向软骨、骨、肌肉和脂肪细胞等方向转化。Indrawattana等报道，利用TGF-β1和IGF-1协同诱导MSCs向软骨细胞分化，软骨基质分泌及特征性基因表达水平均优于单一生长因子诱导，认为联合应用这两种生长因子不单纯是单一作用的叠加，而是发挥协同放大效应。目前国内外未见TGF-β1和IGF-1协同诱导ADSCs向软骨细胞分化的相关报道，但鉴于ADSCs和MSCs基因表达的高度相似性，我们有理由相信，TGF-β1和IGF-1同样能够协同促进ADSCs向软骨细胞定向分化。
试验目的：
探讨大鼠脂肪干细胞(ADSCs)的分离、培养、扩增方法及单层培养条件下外源性转化生长因子TGF-β1和胰岛素样生长因子IGF-1诱导ADSCs向软骨细胞定向分化的可能性及两者的协同作用分析，为应用新型种子细胞构建组织工程软骨提供新思路。
试验方法：
取大鼠大网膜及肾周脂肪囊等处脂肪组织，充分剪碎后加入0.1％Ⅰ型胶原酶，酶消化法及密度梯度离心法相结合，分离、纯化SD大鼠ADSCs，倒置相差显微镜观察各代ADSCs的形态学改变。取第3代生长良好的脂肪干细胞，免疫荧光法检测其表面抗原CD29、CD44表达；取第3代生长良好的脂肪干细胞，分别用四组诱导培养基定向软骨方向诱导，同时设定未诱导组为空白组；诱导2周后细胞爬片，免疫荧光法检测诱导后细胞Ⅱ型胶原的表达；RT-PCR、Western blot对定向诱导后的细胞的表达进行检测。
结果：
1、原代培养的脂肪干细胞24小时即可见细胞贴壁，5d后细胞呈团簇状生长，形成集落。约7d左右细胞融合超过90％时即可传代，传代后细胞生长速度明显加快，形态较均一，呈长梭形，排列紧密，类似成纤维细胞。
2、免疫荧光法检测细胞表面抗原CD29和CD44，结果显示表面抗原CD29和CD44.呈阳性表达，证实为干细胞来源。
3、向软骨方向定向诱导后，各组细胞生长速度均变慢，以对照组为明显；除对照组外，各组细胞形态由梭形变为多边形，多角形，可见细长伪足，核周出现黑色颗粒，随诱导时间延长，细胞开始变圆，核偏位，核周颗粒明显，细胞逐渐聚集成团，形成软骨样结节，TGF-β1组及TGF-β1+IGF-1组较为明显。
4、免疫荧光鉴定诱导后细胞Collaggen Ⅱ表达结果显示IGF-1组、TGF-β1组及TGF-β1+IGF-1组分别呈弱阳性、阳性及强阳性，对照组偶可见单个细胞呈阳性反应，空白组呈阴性反应。
5、RT-PcR检测诱导后细胞Collagen Ⅱ、Aggrecan mRNA表达结果显示，除空白组外其余四组细胞表达CollagenⅡ mRNA，且表达量依次增加，经统计学分析此四组与空白组间及其各自组间差别有统计学意义(P<0.01)；IGF-1组、TGF-β1组及TGF-β1+IGF-1组三组细胞表达Aggrecan mRNA，且表达量依次增加，但空白组及对照组则未见表达，经统计学分析空白组及对照组间差别无统计学意义(P>0.05)，其余三组与此两组间及其各自组间差别有统计学意义(P<0.01)6、Western blot检测诱导后细胞Collagen Ⅱ蛋白表达结果显示，除空白组外其余四组细胞表达Collagen Ⅱ蛋白，且表达量依次增加，经统计学分析此四组与空白组间及其各自组间差别有统计学意义(P<0.01)。
结论：
1、从大鼠脂肪组织中可分离出脂肪干细胞，细胞在体外增生活跃，生物学性状稳定。
2、脂肪干细胞表面抗原CD29和CD44表达阳性，证实为干细胞来源。
3、外源性TGF-β1和IGF-1均能定向诱导ADSCs向软骨方向分化，两者共同诱导时具有协同作用。