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背景及目的:结节性硬化症（Tuberous Sclerosis Complex，TSC）是一种常染色体显性遗传病。TSC作为一种罕见病，不仅以全身多器官多发性肿瘤为特征，而且患者常伴有癫痫发作和智力发育迟缓，其发病原因多由TSC1和TSC2基因突变引起。TSC蛋白复合物（TSC1/TSC2复合物）失活通过小的GTPase Rheb调节雷帕霉素复合物1（也称为mTORC1）的机制靶点或哺乳动物靶点的活性，从而使mTOR处于活化状态。mTOR的超活化被认为是引起TSC肿瘤发生的主要机制，该活化作用可以影响细胞的一系列生物学行为，如细胞增殖、细胞迁移，致使肿瘤的生长。但TSC蛋白复合物失活导致mTOR活化引起TSC肿瘤发生发展的具体机制尚不明确。本研究的目的是深入探索TSC缺失导致mTORC1活化促进TSC肿瘤发生发展的分子机制、相关信号通路以及开发新型靶向药物。
方法:在前期研究中，通过转录组测序发现，与对照细胞（Tsc2+/+MEFs）相比，在Tsc2-/-MEFs中，ERO1L的mRNA丰度升高。首先我们将该结果在TSC缺失细胞中通过WB、qRT-PCR实验进行验证。同时我们在大鼠子宫平滑肌瘤来源的Tsc2缺失细胞、基因敲除小鼠TSC模型、Tsc2+/-小鼠肾肿瘤组织和临床上的样本中也进行更进一步的验证。其次我们利用mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）和mTOR激酶抑制剂（Torin1）处理Tsc1-/-、Tsc2-/-MEFs，研究mTOR活化是否上调ERO1L的表达。我们还利用siRNA干扰和慢病毒感染技术，敲低和过表达ATF3，研究ATF3是否调控ERO1L的表达。然后我们进一步构建了ERO1L过表达的Tsc2+/+MEFs细胞系及ERO1L敲除的Tsc1-/-或Tsc2-/-MEFs细胞系，通过MTT、平板克隆、细胞凋亡等实验，研究ERO1L在TSC缺失细胞中生物学功能。我们还对敲除ERO1L细胞及其对照细胞，进行转录测序，分析差异表达基因。最后我们研究ERO1L特异性抑制剂EN460单独或联合Rapa对细胞增殖的影响。
结果:通过实验，我们首先在TSC缺失细胞以及Tsc2+/-小鼠的肾脏肿瘤、基因敲除小鼠（Tsc1cc Synl-cre+）的脑组织以及临床样本中证实ERO1L是TSC-mTORC1通路下游的重要靶分子，且TSC1/TSC2复合物失活显著上调ERO1L。接着通过mTOR激酶抑制剂Torin1和mTORC1特异性抑制剂Rapa以及siRNAs证实mTORC1活化上调ERO1L的表达。其次通过荧光素酶分析ERO1L启动子发现ATF3调控ERO1L的表达，并通过siRNA及慢病毒技术证实ATF3上调ERO1L表达。然后通过慢病毒及Cas9技术证实ERO1L促进TSC细胞增殖和肿瘤生长。最后通过EN460和Rapa联合用药证实联合用药对细胞增殖的抑制作用比单独用药效果更好。
结论:根据研究结果，本研究得出以下结论：TSC1/TSC2复合物失活通过激活mTORC1-ATF3通路上调ERO1L。ERO1L通过增强细胞增殖，从而促进TSC肿瘤的发生发展。ERO1L特异性抑制剂EN460联合Rapa对TSC的治疗发挥更好的作用。因此，ERO1L可以作为治疗TSC肿瘤及mTORC1活化相关肿瘤的潜在靶点。这一靶点的发现，更深层次地阐明了mTORC1活化促进TSC肿瘤发生发展的分子机制，不仅惠及TSC患者，而且对众多mTORC1活化相关肿瘤的防治具有参考价值，也为肿瘤治疗提供了新策略、新方法。
方法:在前期研究中，通过转录组测序发现，与对照细胞（Tsc2+/+MEFs）相比，在Tsc2-/-MEFs中，ERO1L的mRNA丰度升高。首先我们将该结果在TSC缺失细胞中通过WB、qRT-PCR实验进行验证。同时我们在大鼠子宫平滑肌瘤来源的Tsc2缺失细胞、基因敲除小鼠TSC模型、Tsc2+/-小鼠肾肿瘤组织和临床上的样本中也进行更进一步的验证。其次我们利用mTOR抑制剂雷帕霉素（Rapamycin,Rapa）和mTOR激酶抑制剂（Torin1）处理Tsc1-/-、Tsc2-/-MEFs，研究mTOR活化是否上调ERO1L的表达。我们还利用siRNA干扰和慢病毒感染技术，敲低和过表达ATF3，研究ATF3是否调控ERO1L的表达。然后我们进一步构建了ERO1L过表达的Tsc2+/+MEFs细胞系及ERO1L敲除的Tsc1-/-或Tsc2-/-MEFs细胞系，通过MTT、平板克隆、细胞凋亡等实验，研究ERO1L在TSC缺失细胞中生物学功能。我们还对敲除ERO1L细胞及其对照细胞，进行转录测序，分析差异表达基因。最后我们研究ERO1L特异性抑制剂EN460单独或联合Rapa对细胞增殖的影响。
结果:通过实验，我们首先在TSC缺失细胞以及Tsc2+/-小鼠的肾脏肿瘤、基因敲除小鼠（Tsc1cc Synl-cre+）的脑组织以及临床样本中证实ERO1L是TSC-mTORC1通路下游的重要靶分子，且TSC1/TSC2复合物失活显著上调ERO1L。接着通过mTOR激酶抑制剂Torin1和mTORC1特异性抑制剂Rapa以及siRNAs证实mTORC1活化上调ERO1L的表达。其次通过荧光素酶分析ERO1L启动子发现ATF3调控ERO1L的表达，并通过siRNA及慢病毒技术证实ATF3上调ERO1L表达。然后通过慢病毒及Cas9技术证实ERO1L促进TSC细胞增殖和肿瘤生长。最后通过EN460和Rapa联合用药证实联合用药对细胞增殖的抑制作用比单独用药效果更好。
结论:根据研究结果，本研究得出以下结论：TSC1/TSC2复合物失活通过激活mTORC1-ATF3通路上调ERO1L。ERO1L通过增强细胞增殖，从而促进TSC肿瘤的发生发展。ERO1L特异性抑制剂EN460联合Rapa对TSC的治疗发挥更好的作用。因此，ERO1L可以作为治疗TSC肿瘤及mTORC1活化相关肿瘤的潜在靶点。这一靶点的发现，更深层次地阐明了mTORC1活化促进TSC肿瘤发生发展的分子机制，不仅惠及TSC患者，而且对众多mTORC1活化相关肿瘤的防治具有参考价值，也为肿瘤治疗提供了新策略、新方法。