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番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是我国重要的经济作物之一，富含多种营养成分。目前我国近五分之一的耕地受到了严重的镉（Cd）污染，严重影响农作物产量与品质安全。同时Cd胁迫也会对植物的叶绿体结构和功能造成严重破坏。SGR2为滞绿相关基因，有调节衰老、响应非生物胁迫、调节种子和果实成熟等功能。本实验以番茄商品种“红罗成”为供试材料，克隆获得了SlSGR2基因，利用生物信息学分析了该基因序列；构建GFP亚细胞定位载体，转化拟南芥原生质体在激光共聚焦显微镜下进行了SlSGR2蛋白亚细胞定位；利用不同浓度Cd处理番茄分析了SlSGR2基因的表达模式；构建pCAMBIA2300超表达载体，利用农杆菌介导的遗传转化法侵染拟南芥获得SlSGR2转基因拟南芥，同时采用三引物法鉴定出sgr2拟南芥突变体，观察野生型、过表达、突变体拟南芥株系在Cd胁迫处理下的表型，为番茄SlSGR2基因在Cd胁迫下植物叶绿素降解过程中的作用提供理论支持。主要实验结果如下：
（1）利用0~100μM浓度CdCl2溶液对番茄五叶期植株进行处理，观察番茄叶片表型变化。试验结果表明随着处理时间增长，番茄叶片黄化程度逐渐加深；处理浓度越高，黄化程度越深。上述表型在5d处理较明显。对处理5d番茄第3、4叶片的亚显微结构观察发现随着Cd浓度越高，叶绿体结构受到破坏程度逐渐加深。说明镉胁迫导致番茄叶片黄化，并对叶绿体结构造成破坏。
（2）利用基因克隆技术获得番茄SlSGR2目的片段，全长819bp，编码272个氨基酸。蛋白理化性质分析表明该蛋白属于不稳定亲水蛋白，呈弱碱性；对蛋白质二级和三级结构分析显示存在大量α-螺旋和无规则卷曲；氨基酸序列比对显示与SlSGR2蛋白相似性最高的是马铃薯SGR蛋白，系统进化树表明该蛋白属于单子叶亚族，与马铃薯StSGR蛋白同属一个分支；保守结构域分析显示N-142Phe到N-600Ala之间是SlSGR2蛋白的保守区域，属于Stay-Green超家族；绘制可视化Logo可见，各亚族基序的N端和C端都具有较好的保守性；分析SlSGR2基因上游2500bp启动子区域，发现其具有TATA-box和CAAT-box两个核心启动子元件、光响应元件、参与厌氧呼吸元件、响应赤霉素和脱落酸的元件，以及参与应激反应和逆境胁迫的TC-rich repeats顺式元件。
（3）构建pCAMBIA1302-SlSGR2绿色荧光蛋白GFP融合表达载体，选取未抽薹的拟南芥植株制备原生质体，将空载体和重组载体质粒分别转化原生质体细胞，以空载体为对照在激光共聚焦显微镜下观察SlSGR2基因定位情况。发现SlSGR2基因定位与叶绿体自发红光重合，说明番茄SlSGR2基因定位于叶绿体。
（4）利用0~100μM浓度CdCl2溶液对生长至五叶期的番茄进行胁迫处理，分别在处理后0h、3h、6h、9h、12h对番茄的根、叶取材。经qRT-PCR检测后显示SlSGR2基因在不同Cd处理浓度下均有响应，其中番茄根、叶对50μM CdCl2响应显著，说明番茄SlSGR2基因响应Cd胁迫。
（5）构建番茄SlSGR2基因pCAMBIA2300超量表达载体，转化农杆菌后侵染野生型拟南芥，经PCR和qRT-PCR鉴定，获得T3代转基因株系OE4-1、OE4-2。利用三引物法鉴定出sgr2纯合突变体株系。在Cd胁迫下，SGR2过表达株系生长情况明显优于WT和sgr2；WT和sgr2植株死亡或叶片黄化、白化。对胁迫后拟南芥生理指标测定显示，过表达株系的叶绿素含量显著高于WT和sgr2，而MDA含量显著低于其他株系。说明SGR2基因参与Cd诱导的植物衰老，同时是植物叶绿素降解过程的负调节因子，缓解Cd胁迫损伤。
（1）利用0~100μM浓度CdCl2溶液对番茄五叶期植株进行处理，观察番茄叶片表型变化。试验结果表明随着处理时间增长，番茄叶片黄化程度逐渐加深；处理浓度越高，黄化程度越深。上述表型在5d处理较明显。对处理5d番茄第3、4叶片的亚显微结构观察发现随着Cd浓度越高，叶绿体结构受到破坏程度逐渐加深。说明镉胁迫导致番茄叶片黄化，并对叶绿体结构造成破坏。
（2）利用基因克隆技术获得番茄SlSGR2目的片段，全长819bp，编码272个氨基酸。蛋白理化性质分析表明该蛋白属于不稳定亲水蛋白，呈弱碱性；对蛋白质二级和三级结构分析显示存在大量α-螺旋和无规则卷曲；氨基酸序列比对显示与SlSGR2蛋白相似性最高的是马铃薯SGR蛋白，系统进化树表明该蛋白属于单子叶亚族，与马铃薯StSGR蛋白同属一个分支；保守结构域分析显示N-142Phe到N-600Ala之间是SlSGR2蛋白的保守区域，属于Stay-Green超家族；绘制可视化Logo可见，各亚族基序的N端和C端都具有较好的保守性；分析SlSGR2基因上游2500bp启动子区域，发现其具有TATA-box和CAAT-box两个核心启动子元件、光响应元件、参与厌氧呼吸元件、响应赤霉素和脱落酸的元件，以及参与应激反应和逆境胁迫的TC-rich repeats顺式元件。
（3）构建pCAMBIA1302-SlSGR2绿色荧光蛋白GFP融合表达载体，选取未抽薹的拟南芥植株制备原生质体，将空载体和重组载体质粒分别转化原生质体细胞，以空载体为对照在激光共聚焦显微镜下观察SlSGR2基因定位情况。发现SlSGR2基因定位与叶绿体自发红光重合，说明番茄SlSGR2基因定位于叶绿体。
（4）利用0~100μM浓度CdCl2溶液对生长至五叶期的番茄进行胁迫处理，分别在处理后0h、3h、6h、9h、12h对番茄的根、叶取材。经qRT-PCR检测后显示SlSGR2基因在不同Cd处理浓度下均有响应，其中番茄根、叶对50μM CdCl2响应显著，说明番茄SlSGR2基因响应Cd胁迫。
（5）构建番茄SlSGR2基因pCAMBIA2300超量表达载体，转化农杆菌后侵染野生型拟南芥，经PCR和qRT-PCR鉴定，获得T3代转基因株系OE4-1、OE4-2。利用三引物法鉴定出sgr2纯合突变体株系。在Cd胁迫下，SGR2过表达株系生长情况明显优于WT和sgr2；WT和sgr2植株死亡或叶片黄化、白化。对胁迫后拟南芥生理指标测定显示，过表达株系的叶绿素含量显著高于WT和sgr2，而MDA含量显著低于其他株系。说明SGR2基因参与Cd诱导的植物衰老，同时是植物叶绿素降解过程的负调节因子，缓解Cd胁迫损伤。