铜绿假单胞菌T6SS效应蛋白TseP1的鉴定及其功能研究

• 作 者: 杨建社
• 出 处: 延安大学
• 发表日期: 2020年01期

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）属于非发酵革兰氏阴性细菌,因其具有极强的环境适应能力而广泛分布于各种环境中,如空气、水、土壤、植物、哺乳动物的皮肤、粘膜道等。同时,铜绿假单胞菌也是一种感染范围非常广泛的病原菌,其感染对象主要有植物、昆虫和脊椎动物等。研究表明,铜绿假单胞菌的VI型分泌系统（Type VI secretion system,T6SS）在其适应各种环境以及致病的过程中发挥重要作用。铜绿假单胞菌共编码三套独立的T6SS,分别为H1-、H2-和H3-T6SS,这三套T6SS具有多种生物学功能,如介导金属离子摄取、杀菌、介导细菌与真核细胞间的相互作用等。细菌T6SS的各种生物学功能主要是通过其分泌的效应蛋白来实现的,且T6SS的上述功能都已鉴定出特异的效应蛋白,并对其作用机制作出了很好的解析。然而,虽然有研究报道表明T6SS在一些病原菌对植物致病的过程中发挥重要作用,但其作用机制尚不清楚,其原因主要在于介导细菌与植物之间相互作用的T6SS效应蛋白未被鉴定。本研究以铜绿假单胞菌PAO1为模式菌,以T6SS为主要研究对象,发现了一个可以作用于植物的T6SS效应蛋白PA0115,我们将其命名为TseP1,并对其生物学功能进行了初步研究。具体研究结果如下:1.以Hcp为诱饵蛋白,从铜绿假单胞菌中筛选到了5个能够与Hcp1互作的蛋白,分别为三个T6SS的结构蛋白VgrG1a、VgrG2b和VgrG3以及两个功能未知的蛋白TseP1和PA1969。通过细菌双杂交检测了TseP1、PA1969、VgrG1a、VgrG2b和VgrG3分别与Hcp1的互作情况,结果表明,Hcp1与VgrG1a、VgrG2b、VgrG3以及TseP1互作,而不能与PA1969互作。此外,我们还研究了TseP1与H1-T6SS的三个VgrG蛋白VgrG1a、VgrG1b和VgrG1c之间的互作关系,发现TseP1可以直接与VgrG1a互作,而不能与VgrG1b和VgrG1c互作。2.GST-Pull down实验结果表明,TseP1能够与VgrG1a、Hcp1互作,而不能与VgrG1b、VgrG1c、Hcp3互作,这与细菌双杂交的结果是完全一致的。因此,我们确定了TseP1、VgrG1a、Hcp1这三个蛋白之间的互作关系。蛋白质的分泌检测实验结果表明:TseP1的分泌依赖于H1-T6SS,而不依赖H2-T6SS和H3-T6SS。3.通过大肠杆菌毒性实验,大蜡螟竞争感染实验以及大蜡螟毒性实验,发现TseP1不对大肠杆菌产生毒性作用;TseP1既不影响铜绿假单胞菌在大蜡螟幼虫体内的生存,也不对大蜡螟幼虫产生毒性作用;为了进一步研究TseP1的生物学功能,本研究对TseP1的蛋白结构和其同源蛋白进行了分析,结果表明:TseP1是一个包含乙酰转移酶结构域的蛋白质,TseP1的同源蛋白在细菌中广泛分布,且这些细菌大多数是植物相关细菌。4.通过比较铜绿假单胞菌野生型菌株PAO1和ΔtseP1菌株对绿豆和狗头枣组培苗的侵染能力以及它们对绿豆的毒力,我们发现TseP1可使铜绿假单胞菌对植物的侵染能力更强或者在植物体内的生存能力更强,且TseP1也使铜绿假单胞菌对植物的毒力更强。基于以上的研究结果,本研究提出了TseP1作用于植物的机制模型:当铜绿假单胞菌感染植物时,TseP1经H1-T6SS转位至植物宿主体内,与靶标蛋白结合并对其进行乙酰化修饰,这种修饰作用抑制了植物的免疫受体R蛋白的活性,导致效应蛋白触发的植物免疫反应被抑制,从而促进了铜绿假单胞菌对植物的侵染。