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目的：
1、探讨链脲佐菌素(STZ)建立1型糖尿病大鼠模型的合适剂量。
2、探讨成年SD大鼠胰岛细胞分离、纯化以及质量鉴定的方法。
3、探讨胰岛细胞移植更为安全有效的手术方法。
4、探讨胰岛细胞移植后黏附分子表达与排斥反应的关系。
5、探讨影响移植物再血管化的相关因素。
6、探讨移植物排斥反应与再血管化的关系。
方法：
1、建立糖尿病大鼠模型：将120只wistar大鼠随机分为五组,A组:NS组,NS腹腔内注射；B组：柠檬酸缓冲液组,柠檬酸缓冲液腹腔内注射；C组：STZ腹腔内注射(55mg/Kg);D组:STZ腹腔内注射(65mg/Kg);E组:STZ腹腔内注射(75mg/Kg)。观察注射后外周血血糖值、尿糖值、大鼠体重、饮水量等情况的变化,据既定标准判断五组的成模率。
2、成年SD大鼠胰岛细胞分离、纯化和质量鉴定：经胆总管内逆行灌注胶原酶V的方法消化胰腺组织,Ficol1400非连续密度梯度离心纯化消化产物,获得胰岛细胞后双硫腙(DTZ)染色、吖啶橙-碘丙啶(AO-PI)双染色,结合糖刺激胰岛素释放试验鉴定胰岛细胞的纯度、活率等。
3、(1)经门静脉肝内胰岛细胞移植,改进门静脉穿刺方法,采用荷包缝合法先缝不扎门静脉,然后进行穿刺；(2)观察胰岛细胞移植后移植前后外周血血糖变化,及术后肝组织内CD106、CD49d、CD62P、CD62E及FⅧ因子相关抗原(FⅧ-RA)的表达变化：50只同一批wistar糖尿病模型大鼠遵循“随机、双盲、对照”原则分为五组:A组,糖尿病模型组,常规喂食之外不做任何处理；B组,DMEM组,糖尿病患鼠经门静脉注射达尔伯克(氏)必需基本培养液(DMEM液,0.8～1.0ml/kg,含糖5.6mmol/L),术前一天开始经腹腔注射NS,每天1ml,直至实验结束；C组,NS组,经门静脉移植已纯化好的胰岛细胞,胰岛细胞移植物来自SD大鼠,两只正常SD大鼠胰岛细胞供给一只wistar大鼠糖尿病动物模型,术前一天开始经腹腔注射NS,每天1ml,直至实验结束；D组,免疫抑制剂组,经门静脉移植已纯化好的胰岛细胞,胰岛细胞移植物来自SD大鼠,两只正常SD大鼠胰岛细胞供给一只Wistar大鼠糖尿病动物模型,术前1天开始经腹腔注射CsA(3 mg/kg·d)+MMF(20mg/kg·d),每天一次；E组,低分子肝素组,术前1天开始皮下注射低分子肝素组(4 mg/kg·d)。其中C、D组及E组胰岛细胞来自SD大鼠,提取两只正常SD大鼠胰岛细胞供给一只Wistar糖尿病大鼠。以血糖仪检测外周血血糖；免疫组织化学法检测肝组织CD106、CD49d、CD62P、CD62E及FVⅢ-RA,并以专业图像软件进行分析。
结果：
1、A组、B组成模率为0,C组成模率为8.33％,D组和E组成模率为91.67％；成模率比较:D组、E组与C组比较,有统计学意义(P<0.05),D组与E组之间无统计学意义(P>0.05);D组和E组大鼠注射STZ后血糖值明显增高、体重增加明显减缓或不增加,一般情况较差,饮水量和大小便量明显增加。2周内死亡率D组为零,E组为27.3％。E组感染率高达50％。
2、大鼠胰腺经纯化后获得的胰岛细胞数为430-670个胰岛/胰腺,平均为520±70个胰岛/胰腺,活率在90％以上,纯度为85％以上,胰岛素释放试验显示大鼠胰岛细胞经高糖刺激后胰岛素分泌是低糖时的2.8倍,即刺激指数为2.8,提示胰岛细胞功能良好。
3、(1)经门静脉肝内胰岛细胞移植后,胰岛细胞形态功能良好,未发生门脉高压、门静脉栓塞等严重并发症；(2)手术前后各组外周血血糖值,术后肝组织中CD106,术后10天肝组织中CD62P、CD62E及术后60天肝组织中FVⅢ-RA表达比较:A组与B组、D组与E比较组间无统计学差异,其余任何两组间比较均有统计学差异(P<0.05)。术后肝组织中CD49d表达比较:A组同B组无统计学差别,C组同E组无统计学差别,其余任何两组间比较均有统计学差异(P<0.05)。术后10天肝组织中FVⅢ-RA及术后60天肝组织中CD62E表达比较：A组、B组、E组组间无统计学差异,其余任何两组间比较均有统计学差异。术后60天肝组织中CD62P表达比较:C组同其余组均有统计学差别,其余任何两组间比较无统计学差异。外周血血糖变化,在B组中与CD49d呈正相关性,在D组中与CD106、CD49d及CD62E呈负相关性。FVⅢ-RA表达,与各组中CD49d表达呈正相关性,与E组中CD62P表达呈负相关性。FVⅢ-RA表达,与B、E组中外周血血糖变化呈正相关性,与C、D组中外周血血糖变化呈负相关性。总体来说,PIT后免疫抑制剂组和低分子肝素组获得较为理想的血糖,A、B组血糖无明显变化,C组血糖值逐渐升至A、B组水平。
结论：
1、STZ是建立糖尿病动物模型理想药物之一；65mg/Kg的STZ是较为安全、有效的剂量。
2、良好的穿刺技术,消化后适度振摇,控制消化酶浓度及时间,利于提高胰岛细胞的收获率；DTZ、AO-PI染色及胰岛素释放试验三者相结合鉴定胰岛细胞质量易行可靠。
3、选择恰当的穿刺针直径、合适的穿刺点和采用荷包缝合法,熟练的操作技术,门静脉途径进行肝内胰岛细胞移植,是一种安全有效的方法。
4、胰岛细胞移植后,胰岛细胞移植后CD106、CD49d、CD62P和CD62E表达与排斥反应呈正相关。
5、胰岛细胞移植后,FVⅢ-RA表达与移植物功能呈正相关。
6、胰岛细胞移植后,排斥反应抑制移植物再血管化。