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研究背景与目的：
白血病是血液系统的恶性肿瘤,目前很多研究表明急性白血病的发生涉及累积突变的渐进式遗传学改变。由于造血干细胞(HSC)具有自我更新和多能分化的潜力,因此它们经受这种累积遗传学改变后最终导致白血病基因的形成。科学家将这些能引起白血病发生的干细胞称为白血病干细胞(LSC)。
近20年来白血病的治疗虽取得很大的进展,但治疗效果仍不尽人意,多数患者在完全缓解后还会出现复发,并最终死亡。常规化疗只能杀灭增殖周期的细胞,然而,LSC在细胞生物学方面不同于增殖较快的幼稚白血病细胞,它通常处于Go期,对常规的化疗无反应。目前单抗的靶向治疗研究较多,但如果仅针对增殖周期的肿瘤细胞表面标志,或许会取得暂时的明显临床疗效,但因肿瘤干细胞的存在终会导致疾病复发。因此要根除白血病的前提仍然是弄清不同亚型的不同起源细胞的分子标志,直接针对LSC的靶向治疗,从源头上对白血病进行治疗,可望成为治愈白血病的一个新策略。SALL4是一种新发现的原癌基因,编码的转录因子作用于干细胞水平,影响正常胚胎细胞的发育和肿瘤干细胞的发生。V Frecer等研究发现LEFl和TCF4E能有效激活SALL4转录,并形成TCF/F突变结合体,从而激活经典的writ信号转导通路。Wnt信号的靶基因c-myc、cyclin D1、MMP-7、CD44、Claudm-1等在肿瘤发生发展过程中扮演了重要的角色,提示SAILL4基因具有导致肿瘤发生的潜能。
SALL4由于其致瘤的潜能和维持干细胞特性,使人们开始关注它与白血病发生的关系。本研究从临床上观察SALL4基因在不同类型白血病外周血或骨髓细胞中的表达水平,探索SALL4基因是否为淋巴细胞白血病的标记之一。并通过含hsALLAB基因全序列的逆转录病毒载体和含hSALL4-siRNA序列的逆转录病毒载体的扩增,然后转染、包装并筛选出稳定产病毒的细胞系,为阐明SALL4基因是否能促进B细胞白血病/淋巴瘤的发生提供实验依据。
研究内容和方法：
一、SALL4基因在白血病中的表达及其意义
1、细胞培养用DMEM高糖培养基37℃,5％CO2培养复苏后的293细胞,2天换液一次,3-5日传代,选取生长状态好的一瓶细胞,控制细胞数量在1×106,用于提取总RNA用作RT-PCR检测标本的阳性对照。
2、运用RT-PCR技术对35例白血病患者及10例对照组人员的骨髓或外周血细胞进行SALL4 mRNA表达测定。
二、含人SALL4B基因及其siRNA逆转录病毒载体系统的建立
1、含hSALL4B基因全序列的逆转录病毒载体和含hSALL4-siRNA序列的逆转录病毒载体的扩增和鉴定。
2、实验分组及体外转染实验：将实验设为4组,hSALL4B-pLXSN(SALL4过表达组)和pLXSN对照组；hSALL4-siRNA-pSuper(SALL4低表达组)和pSuper对照组。用脂质体2000将hSALL4B-pLXSN、hSALL4-siRNA-pSuper、空载体pLXSN和pSuper转染逆转录病毒包装细胞系PT67,用G418筛选稳定转染的克隆,搜集病毒上清。
3、用3T3细胞测定病毒滴度。
结果：
1、ANLL患者中,SALL4 mRNA表达率为83.3％(15/18例);CML患者SALL4mRNA表达率为100％(7/7例);B-ALL患者中,SALL4 tuRNA表达率为100％(6/6例),T-ALL的SALL4 mRNA表达率为0％(0/4例)。对照组10例的SALL4 mRNA表达为阴性。ANLL、CML、B-ALL之间SALL4 mRNA的表达率比较无统计学差异(P>0.05),前三组与T-ALL、对照组间SALL4 mRNA的表达存在显著性差异(P<0.01)。进一步检测ALL、CML组BCR-ABL融合基因的表达,发现其与SALL4的表达呈正相关性。
2、我们用G418筛选出稳定转染hSALL4B-pLXSN、hSALL4-siRNA-pSuper、空载体pLXSN和pSuper的病毒包装细胞系PT67,再用有限稀释法获得单个阳性细胞克隆。经3T3细胞测定病毒滴度为hSALL4B-pLXSN 1.66×106CFU/ml,pLXSN 2.41×106 CFU/ml,hSALL4-siRNA-pSpuer 3.2×106CFU/ml,pSuper4.34×106 CFU/ml。
结论：
1、ANLL、CML、B-ALL骨髓或外周血细胞SALL4mRNA的表达阳性,对照组表达阴性,提示SALL4基因可能与白血病的发生相关；B-ALL与T-ALL间的SALL4基因表达存在显著差异,提示两者的发病机制可能不同。
2、我们运用稳定转染和有限稀释法成功培育出产高滴度hSALL4B-pLXSN、hSALL4-siRNA-pSuper、空载体pLXSN和pSupef逆转录病毒包装细胞系PT67。为进一步通过体外逆转录病毒感染,研究SALL4基因对促进B细胞白血病/淋巴瘤发生所起的作用奠定实验基础。