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[目的]p33INGlb是一种重要的肿瘤抑制因子，其功能与p53蛋白密切相关。在包括恶性胶质瘤在内的众多恶性肿瘤中，其胞浆蓄积的亚细胞定位异常非常常见，但机制尚不清楚。有报导在HeLa细胞中，14-3-3η蛋白可与199位丝氨酸磷酸化的p33INGlb结合，结合后阻止后者的入核转运，将其滞留于胞浆，使其抑瘤作用消失；亦有报导通过联合转染外源性p53与p33INGlb基因，使二者在恶性胶质瘤细胞中共表达可增加后者入核转运效率，但在恶性胶质瘤细胞中p33ING1b胞浆蓄积的确切机制尚待进一步研究证实。本研究旨在观察恶性胶质瘤细胞系中14-3-3η蛋白及野生和突变型p53蛋白表达与p33INGlb异常胞浆蓄积之间的关系，以便对恶性胶质瘤细胞中影响p33INGlb亚细胞定位的机制进行初步探讨。
[方法]
①本室先前曾以EGFP为标签蛋白标记外源性p33INGlb，构建了EGFP-p33INGlb真核表达载体pEGFP-Cl-p33INGlb；在此基础上，我们采用定点诱变技术将p33INGlb ORF的595位核苷酸由T诱变为G，构建不能与14-3-3η蛋白结合的S199A型p33INGlb突变体(EGFP-p33INGlbS199A)的真核表达载体pEGFP-Cl-p33INGlbS199A。②用pEGFP-C1-P33INGlb及pEGFP-C1-P33INGlbS199A分别转染TJ905细胞，观察两种EGFP标记的p33INGlb的亚细胞定位情况，并通过14-3-3η蛋白荧光免疫细胞化学检测观察其与两种EGFP标记的p33INGlb的相互作用情况；③分离培养EGFP-p33INGlb亚细胞定位不同的TJ905细胞亚细胞系，采用Western Blot技术对各亚细胞系EGFP-p33INGlb的表达水平进行检测，采用RT-PCR技术分别由HEK293和TJ905亚细胞系中扩增野生型(p53wt)和突变型p53(p53mt)的cDNA片段，测序检测其序列和突变情况；④利用IRES构建介导p53wt或p53mt蛋白与EGFP-p33INGlb联合表达的真核表达质粒pEGFP-Cl-p33INGlb-IRES-p53wt/mt，以便在真核细胞中以单一双顺反子mRNA介导EGFP-p33INGlb和p53wt或p53mt蛋白的联合表达；⑤分别以pEGFP-Cl-P33INGlb及pEGFP-Cl-p33INGlb-IRES-p53wt/mt质粒转染非肿瘤永生化HEK293细胞系和恶性胶质瘤细胞系U87MG，观察EGFP-p33INGlb亚细胞定位情况及p53wt和p53mt蛋白对其亚细胞定位的影响。
[结果]
①通过定点诱变技术成功构建了介导EGFP-p33INGlbS199A表达的真核表达载体pEGFP-Cl-p33INGlbS199A，测序证实其p33INGlb ORF中595T→G突变的存在。②分别以pEGFP-Cl-p33INGlb及pEGFP-Cl-p33INGlbS199A转染TJ905细胞系培养48hr后，EGFP-p33INGlb及EGFP-p33INGlbS199A的胞浆蓄积指数分别为42.46±1.33％和42.45±0.97％，差异无显著性(P>0.05)；荧光免疫细胞化学检测证实，虽然转染细胞均高表达14-3-3η蛋白，但14-3-3η蛋白与EGFP-p33INGlb及EGFP- p33INGlbS199A均无显著重叠，也不改变后两者的入核效率，说明恶性胶质瘤细胞中高表达的14-3-3η蛋白并不与p33INGlb相互作用，14-3-3η蛋白高表达不是造成p33INGlb入核障碍的根本原因。③成功分离出4个EGFP-p33INGlb亚细胞定位不同的TJ905亚细胞系，其中3个有EGFP-p33INGlb胞浆蓄积，分别命名为TJ905亚细胞系1～3，1个EGFP-p33INGlb完全定位于胞核而无胞浆蓄积，命名为TJ905亚细胞系4，Western Blot检测显示4个TJ905亚细胞系EGFP-p33INGlb表达水平无显著性差异(P>0.05)。④分别从HEK293细胞系和4个TJ905亚细胞系中扩增出了p53wt cDNA片段和4种p53mt cDNA片段(p53mtl～4)，测序结果显示，来自有EGFP-p33INGlb胞浆蓄积的3个TJ905亚细胞系的3种p53mt cDNA片段(p53mtl～3)其ORF均有215，G→C突变，且该突变为TJ905亚细胞系2唯一的p53突变点，该突变造成第72位氨基酸残基由精氨酸替换为脯氨酸(R72P)；而来自无EGFP-p33INGlb胞浆蓄积的TJ905亚细胞系4的p53mt cDNA片段(p53mt4)中虽有ORF其它位点的突变，但无215，G→C突变，提示R72P突变是影响p33INGlb亚细胞定位异常的主要原因。⑤成功构建了介导p53wt蛋白及4种p53mt蛋白(p53mtl～4)与EGFP-p33INGlb联合表达的真核表达质粒pEGFP-Cl-p33INGlb-IRES-p53wt及pEGFP-Cl-p33INGlb-IRES-p53mtl～4。⑥分别以pEGFP-Cl-p33INGlb、pEGFP-Cl-p33INGlb-IRES-p53wt及pEGFP-Cl-p33INGlb-IRES-p53mtl～4转染HEK293和U87MG细胞系，计算各组转染细胞EGFP-p33INGlb的胞浆蓄积指数。结果发现在HEK293细胞中，单纯表达EGFP-p33INGlb组(8.20±2.08％)及EGFP-p33INGlb与p53wt蛋白共表达组(6.57±2.20％)或与p53mt4蛋白共表达组(9.85±2.66％)的EGFP-p33INGlb胞浆蓄积指数均无显著性差异(P>0.05)，但三者均明显低于EGFP-p33INGlb分别与p53mt1、p53mt2、p53mt3蛋白共表达各组的EGFP-p33INGlb胞浆蓄积指数(分别为17.45±6，14％、18.68±6.09％、15.78±1.11％)，差异均有显著性(P<0.001)，提示携带R72P突变的p53蛋白可提高EGFP-p33INGlb在HEK293细胞中的胞浆蓄积指数；而在U87MG细胞中，单纯表达EGFP-p33INGlb组(38.83±0.90％)、EGFP-p33INGlb分别与p53mt1、p53mt2、p53mt3蛋白共表达各组的EGFP-p33INGlb胞浆蓄积指数(分别为40.00±6.28％、40.50±3.43％、41.83±3.42％)彼此间均无显著性差异(P>0.05)，但后三者均明显高于EGFP-p33INGlb与p53wt蛋白或与p53mt4蛋白共表达组的EGFP-p33INGlb胞浆蓄积指数(分别为28.87±3.97％和28.77±1.94％)，差异均有显著性(P<0.001)，提示在U87MG细胞中p53wt蛋白和不携带R72P突变的p53mt4蛋白均可降低EGFP-p33INGlb的胞浆蓄积指数。
[结论]
①p33INGlb入核障碍并在胞浆中异常蓄积是恶性胶质瘤细胞的固有特征，而恶性胶质瘤细胞的p33INGlb表达水平与其p33INGlb亚细胞定位异常无关。②恶性胶质瘤细胞普遍表达14-3-3η蛋白，但其14-3-3η蛋白并不与p33INGlb结合，说明14-3-3η蛋白高表达不是造成其p33INGlb入核障碍的根本原因。③人TJ905胶质母细胞瘤细胞系中存在p53基因突变位点各有不同的4个亚细胞系；但亚细胞系1、2、3的共同特点是均有p53基因第215位碱基G→C突变(215，G→C)，其编码蛋白的第72位精氨酸→脯氨酸(R72P型突变)，而亚细胞系4无p53基因215，G→C突变；说明即使同一例胶质母细胞瘤中也存在分子遗传学变异背景不同的细胞亚群。④胶质母细胞瘤细胞的p53基因215，G→C突变及由此引起的p53蛋白R72P突变，是导致其p33INGlb入核障碍并在胞浆异常蓄积重要原因。⑤胶质母细胞瘤细胞中可能还有其他影响p33INGlb亚细胞定位的因素，其确切机制尚有待进一步研究。