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Wolbachia是一种广泛感染节肢动物的胞内共生细菌，其主要分布于昆虫的生殖系统和神经系统。前期研究主要集中在Wolbachia感染对宿主生殖系统的影响，研究发现Wolbachia能够通过多种机制调节宿主的生殖方式，如细胞质不亲和(cytoplasmic incompatibility，CI)、孤雌生殖、雌性化和杀雄等，这些方式能增加其在雌性宿主种群中感染频率，利于自身从宿主母体到子代的传播。然而，虽然Wolbachia也能感染昆虫神经系统（包括脑），但其对于宿主的睡眠节律、学习与记忆能力（learning and memory capacity，LMC）等的影响还鲜有研究报道。研究Wolbachia感染对宿主行为的影响能有助于更好地了解宿主/内共生菌相互作用的生物学过程，特别是Wolbachia对无脊椎动物宿主神经生物学的影响。
首先，通过透射电镜和荧光原位杂交发现，wMel Wolbachia广泛分布于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的大脑中。然后，用Drosophila activity monitor system(DAMS)系统来检测黑腹果蝇的睡眠时间、昼夜节律等各项指标，并通过机械振动剥夺果蝇的睡眠来检测果蝇的睡眠稳态与觉醒阈值。结果显示，与未感染的对照组果蝇(Dmel T)相比，wMel Wolbachia感染的黑腹果蝇(Dmel wMel)睡眠总时间增加，特别是夜晚睡眠片段次数增加，然而夜晚睡眠片段持续时间不变。同时感染Wolbachia的果蝇觉醒阈值降低，容易因外界刺激而觉醒，且睡眠潜伏期显著延长，即觉醒后至下一次睡眠的时间间隔延长。但睡眠剥夺后睡眠补偿时间不变，昼夜节律也没有变化。由于有研究表明，睡眠与多巴胺途径相关，随后又采用定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法，检测了多巴胺合成途径的两个关键基因Pale和Ddc的表达水平，结果发现，与未感染的对照组相比，在Wolbachia感染果蝇中这两个基因表达显著上调。这些结果表明，Wolbachia可能通过多巴胺途径而影响宿主果蝇的睡眠行为，降低了睡眠质量。
已有研究发现，睡眠行为通常与学习记忆密切相关。由于Wolbachia可能通过多巴胺途径而影响宿主果蝇的睡眠行为，推测，Wolbachia可能也影响宿主果蝇学习与记忆能力。因此，采取条件性刺激学习模式，以两种气味（3-辛醇和4-甲基环己醇）与蔗糖溶液（作为奖励）联合，在T型迷宫中分别检测了感染wMel Wolbachia的黑腹果蝇和感染wRi Wolbachia的拟果蝇的学习与记忆能力。学习与记忆能力用学习记忆能力指数PI(Performance Index)来评价，即通过选择条件气味的果蝇数量减去选择无条件的气味的果蝇数量，再除以果蝇总数来计算的。结果显示:感染Wolbachia的黑腹果蝇的学习与记忆能力显著高于对照组（学习能力指数分别为:0.254±0.01、0.189±0.009）（p＜0.01）;感染Wolbachia的拟果蝇(Dsim wRi)的学习与记忆能力也显著高于对照组(Dsim T)（学习与记忆能力指数分别为:0.247±0.005、0.177±0.006）(p＜0.01），即Wolbachia感染后能显著提高宿主果蝇的学习与记忆能力。
随后，为了进一步研究Wolbachia感染显著提高宿主果蝇学习与记忆能力的分子机制，主要在传统模式生物黑腹果蝇中进行研究。先检测了感染wMel菌株的黑腹果蝇头部13个学习与记忆能力相关基因的表达量，qRT-PCR分析发现，crebB、DopR、rut、dunce、crebA等5个基因表达量显著上调;其中，与对照组相比，Dmel wMel果蝇头部crebA表达上调倍数最高。为研究Wolbachia感染提高果蝇学习与记忆能力是否与crebA密切相关，采用crebA RNAi干扰品系，用UAS/Gal4系统驱动crebA在感染Wolbachia果蝇中广泛性敲降;与此同时，在未感染Wolbachia的果蝇中过量表达crebA。结果显示，在Wolbachia感染的果蝇中，crebA的敲降显著降低了LMC;相反，在未感染Wolbachia的果蝇中，crebA的过表达显著增强了果蝇的LMC。这一结果表明，Wolbachia感染后，crebA表达水平上调可能是果蝇学习与记忆能力提高的主要原因之一。
基于Wolbachia感染宿主后会改变宿主microRNAs(miRNAs)转录以调节宿主基因的表达，推测，可能有一种microRNA能够调控果蝇crebA的表达，从而影响宿主的适应性或学习行为。利用生物学软件（RNA22，RNAHybrid）搜索，发现一种miRNA—dme-miR-92b能与crebA的3UTR区1557-1564位置互补。利用qRT-PCR分析发现，Dmel wMel中dme-miR-92b的表达量与Dmel T相比显著降低(p＜0.01)。这一结果表明，dme-miR-92b在果蝇中可能抑制crebA的表达。
因此，采用两个独立实验来探明crebA转录是否被dme-miR-92b抑制:(1)将合成的dme-miR-92b的类似物或抑制剂（反向互补序列）转染未感染Wolbachia的果蝇S2细胞中，作为实验组;将不相关的miRNA序列（类似物对照）或miRNA阴性对照（抑制剂对照）转染到S2细胞中，作为对照组。转染48h后检测细胞中crebA的转录水平。结果发现，转染dme-miR-92b类似物的细胞中crebA的转录水平显著低于转染对照组;相反，转染dme-miR-92b抑制剂后crebA表达显著高于对照组。这些结果证实，dme-miR-92b对crebA的表达确实起负调控作用。(2)为明确crebA是否是dme-miR-92b的直接靶标，将crebA的3UTR种子区域(seed region)和其种子区域中4bp突变了的crebA的3UTR区域的片段分别克隆到psiCHECK2双荧光素报告质粒中。将重组质粒与dme-miR-92b类似物和miRNA对照(miRNANC)共转染到S2细胞中。结果显示，dme-miR-92b类似物与含有crebA3UTR报告质粒共转染导致荧光素酶活性极显著降低，不到其他组的50％（p＜0.01）。当dme-miR-92b类似物与3UTR突变体报告质粒或空质粒一起转染时，未观察到荧光素酶活性的显著改变，表明crebA中的预测位点确实是dme-miR-92b的直接作用靶标位置。这些结果表明，dme-miR-92b可能通过靶向crebA的3UTR区直接负调控果蝇crebA的表达。
为了探究Wolbachia是否通过dme-miR-92b调控crebA表达而影响宿主果蝇学习与记忆能力，合成了dme-miR-92b的模拟物agomirs与拮抗剂antagomir，将其注射到果蝇中。结果发现，显微注射dme-miR-92b的模拟物agomirs到Dmel wMel果蝇后，crebA表达和LMC显著降低，而将dme-miR-92b的拮抗剂antagomir注射到Dmel T果蝇后，crebA表达和LMC显著增加。这些结果进一步证明，Wolbachia可能通过miRNA途径调控宿主基因表达来影响宿主果蝇的学习与记忆能力。
综上所述，Wolbachia可能通过多巴胺途径而影响宿主果蝇的睡眠行为，增加了果蝇的睡眠时间，降低了果蝇的睡眠质量。同时，Wolbachia可能通过dme-miR-92b靶向调控crebA基因的表达来提高宿主果蝇的学习与记忆能力。我们的研究结果有助于更好地了解宿主/内共生菌相互作用的生物学过程，特别是Wolbachi对无脊椎动物宿主神经生物学的影响。由于Wolbachia感染的许多宿主（如:节肢动物、线虫）都是很多脊椎动物病原生物的中间宿主，因此本研究在害虫的生物防治研究过程中也有重要的意义。
首先，通过透射电镜和荧光原位杂交发现，wMel Wolbachia广泛分布于黑腹果蝇（Drosophila melanogaster）的大脑中。然后，用Drosophila activity monitor system(DAMS)系统来检测黑腹果蝇的睡眠时间、昼夜节律等各项指标，并通过机械振动剥夺果蝇的睡眠来检测果蝇的睡眠稳态与觉醒阈值。结果显示，与未感染的对照组果蝇(Dmel T)相比，wMel Wolbachia感染的黑腹果蝇(Dmel wMel)睡眠总时间增加，特别是夜晚睡眠片段次数增加，然而夜晚睡眠片段持续时间不变。同时感染Wolbachia的果蝇觉醒阈值降低，容易因外界刺激而觉醒，且睡眠潜伏期显著延长，即觉醒后至下一次睡眠的时间间隔延长。但睡眠剥夺后睡眠补偿时间不变，昼夜节律也没有变化。由于有研究表明，睡眠与多巴胺途径相关，随后又采用定量RT-PCR(qRT-PCR)的方法，检测了多巴胺合成途径的两个关键基因Pale和Ddc的表达水平，结果发现，与未感染的对照组相比，在Wolbachia感染果蝇中这两个基因表达显著上调。这些结果表明，Wolbachia可能通过多巴胺途径而影响宿主果蝇的睡眠行为，降低了睡眠质量。
已有研究发现，睡眠行为通常与学习记忆密切相关。由于Wolbachia可能通过多巴胺途径而影响宿主果蝇的睡眠行为，推测，Wolbachia可能也影响宿主果蝇学习与记忆能力。因此，采取条件性刺激学习模式，以两种气味（3-辛醇和4-甲基环己醇）与蔗糖溶液（作为奖励）联合，在T型迷宫中分别检测了感染wMel Wolbachia的黑腹果蝇和感染wRi Wolbachia的拟果蝇的学习与记忆能力。学习与记忆能力用学习记忆能力指数PI(Performance Index)来评价，即通过选择条件气味的果蝇数量减去选择无条件的气味的果蝇数量，再除以果蝇总数来计算的。结果显示:感染Wolbachia的黑腹果蝇的学习与记忆能力显著高于对照组（学习能力指数分别为:0.254±0.01、0.189±0.009）（p＜0.01）;感染Wolbachia的拟果蝇(Dsim wRi)的学习与记忆能力也显著高于对照组(Dsim T)（学习与记忆能力指数分别为:0.247±0.005、0.177±0.006）(p＜0.01），即Wolbachia感染后能显著提高宿主果蝇的学习与记忆能力。
随后，为了进一步研究Wolbachia感染显著提高宿主果蝇学习与记忆能力的分子机制，主要在传统模式生物黑腹果蝇中进行研究。先检测了感染wMel菌株的黑腹果蝇头部13个学习与记忆能力相关基因的表达量，qRT-PCR分析发现，crebB、DopR、rut、dunce、crebA等5个基因表达量显著上调;其中，与对照组相比，Dmel wMel果蝇头部crebA表达上调倍数最高。为研究Wolbachia感染提高果蝇学习与记忆能力是否与crebA密切相关，采用crebA RNAi干扰品系，用UAS/Gal4系统驱动crebA在感染Wolbachia果蝇中广泛性敲降;与此同时，在未感染Wolbachia的果蝇中过量表达crebA。结果显示，在Wolbachia感染的果蝇中，crebA的敲降显著降低了LMC;相反，在未感染Wolbachia的果蝇中，crebA的过表达显著增强了果蝇的LMC。这一结果表明，Wolbachia感染后，crebA表达水平上调可能是果蝇学习与记忆能力提高的主要原因之一。
基于Wolbachia感染宿主后会改变宿主microRNAs(miRNAs)转录以调节宿主基因的表达，推测，可能有一种microRNA能够调控果蝇crebA的表达，从而影响宿主的适应性或学习行为。利用生物学软件（RNA22，RNAHybrid）搜索，发现一种miRNA—dme-miR-92b能与crebA的3UTR区1557-1564位置互补。利用qRT-PCR分析发现，Dmel wMel中dme-miR-92b的表达量与Dmel T相比显著降低(p＜0.01)。这一结果表明，dme-miR-92b在果蝇中可能抑制crebA的表达。
因此，采用两个独立实验来探明crebA转录是否被dme-miR-92b抑制:(1)将合成的dme-miR-92b的类似物或抑制剂（反向互补序列）转染未感染Wolbachia的果蝇S2细胞中，作为实验组;将不相关的miRNA序列（类似物对照）或miRNA阴性对照（抑制剂对照）转染到S2细胞中，作为对照组。转染48h后检测细胞中crebA的转录水平。结果发现，转染dme-miR-92b类似物的细胞中crebA的转录水平显著低于转染对照组;相反，转染dme-miR-92b抑制剂后crebA表达显著高于对照组。这些结果证实，dme-miR-92b对crebA的表达确实起负调控作用。(2)为明确crebA是否是dme-miR-92b的直接靶标，将crebA的3UTR种子区域(seed region)和其种子区域中4bp突变了的crebA的3UTR区域的片段分别克隆到psiCHECK2双荧光素报告质粒中。将重组质粒与dme-miR-92b类似物和miRNA对照(miRNANC)共转染到S2细胞中。结果显示，dme-miR-92b类似物与含有crebA3UTR报告质粒共转染导致荧光素酶活性极显著降低，不到其他组的50％（p＜0.01）。当dme-miR-92b类似物与3UTR突变体报告质粒或空质粒一起转染时，未观察到荧光素酶活性的显著改变，表明crebA中的预测位点确实是dme-miR-92b的直接作用靶标位置。这些结果表明，dme-miR-92b可能通过靶向crebA的3UTR区直接负调控果蝇crebA的表达。
为了探究Wolbachia是否通过dme-miR-92b调控crebA表达而影响宿主果蝇学习与记忆能力，合成了dme-miR-92b的模拟物agomirs与拮抗剂antagomir，将其注射到果蝇中。结果发现，显微注射dme-miR-92b的模拟物agomirs到Dmel wMel果蝇后，crebA表达和LMC显著降低，而将dme-miR-92b的拮抗剂antagomir注射到Dmel T果蝇后，crebA表达和LMC显著增加。这些结果进一步证明，Wolbachia可能通过miRNA途径调控宿主基因表达来影响宿主果蝇的学习与记忆能力。
综上所述，Wolbachia可能通过多巴胺途径而影响宿主果蝇的睡眠行为，增加了果蝇的睡眠时间，降低了果蝇的睡眠质量。同时，Wolbachia可能通过dme-miR-92b靶向调控crebA基因的表达来提高宿主果蝇的学习与记忆能力。我们的研究结果有助于更好地了解宿主/内共生菌相互作用的生物学过程，特别是Wolbachi对无脊椎动物宿主神经生物学的影响。由于Wolbachia感染的许多宿主（如:节肢动物、线虫）都是很多脊椎动物病原生物的中间宿主，因此本研究在害虫的生物防治研究过程中也有重要的意义。